免疫学技术在科研中的应用Part-III.ppt

CD5 is a cluster of differentiation found on a subset of IgM-secreting B cells called B-1 cells, and also on T cells * 诱导T细胞增殖反应的丝裂原 1. PHA（植物血凝素） 2. Con A（刀豆蛋白 A） 3. PMN（美洲商陆） 方法： 1. 用RPMI－10将PBMC配成1x106/ml的悬液。 2. 用100g/ml的PHA配制1:10、1:20和1:40稀释液。 3. 96孔板中选择一行（共12孔），每孔加入100μl细胞。 指定每相邻3孔为一组。前3组分别加入一种稀释度的 PHA溶液，最后一组加培养液（对照组）。 4. 37°C ，5％CO2，54h。 5. 配制浓度为100μci/ml的3HTdR。 6. 每孔加入1μci 3HTdR，继续培养18h。 7. 用多孔自动收集仪分别收集每孔细胞于一小管中。溶 解细胞，将DNA过滤到滤纸上，洗去未掺入的3HTdR ，最后用100％的甲醇洗涤，以利滤纸干燥。 8. 将滤纸放入液闪管内，自动计数，打印结果。 9. 扣除本底，计算每一组3个复本的平均数。 影响因素 1. 细胞活力：冷冻技术影响细胞活力，复苏后应检查细胞活力。 2. 培养液中添加的血清：有些血清可能激活或抑制细胞增殖。如欲测定人体细胞增殖能力，可采用灭活的AB血清。 3. 细胞培养板类型：根据细胞数量采用不同形状底部的培养板。 4. 微生物污染：可降低细胞增殖能力。 应用实践 临床上用于评估T细胞对多克隆刺激剂的增殖能力，反映T细胞基本免疫功能，即T细胞群总体的信息，不能反映个别T细胞克隆的情况 PHA常用于测试人T细胞增殖能力，Con A常用于测试小鼠T细胞增殖能力。 原 理 T细胞受体能够识别同种异型MHC分子。当把2个不同个体的单个核细胞在体外混合时，可以相互刺激，引起增殖。增殖的强度与两者之间MHC的差别的程度成正比。所以同种异型混合淋巴细胞反应的强度反映2个个体之间MHC差别的程度，并且因为相互识别与增殖，结果是2个个体的淋巴细胞增殖能力的总和。这种试验就是双向混合淋巴细胞培养试验。 将参加反应之一方的单个核细胞用放射性核素照射，使其失去反应能力，但仍保存刺激能力，成为刺激细胞，则此时的反应结果仅反映另一方（反应方）的增殖能力。在实质性器官移植时，只需了解受者淋巴细胞对供者MHC的反应能力，所以适合采用单向混合淋巴细胞培养反应。 方法 1. 分离宿主与供者的PBMC，调整细胞浓度为1 x 106/ml 2. 刺激细胞灭活：用丝裂霉素（终浓度25μg，37 °C， 5％C，30min）或放射性核素照射（2000 rad）的方法处理刺激细胞。 3. 96孔板中，每孔加入1x105的刺激细胞和1x105反应细胞。 37°C，5％CO2，4～6d。加3HTdR，继续培养18h。阳性对照孔加反应细胞和丝裂原，不加刺激细胞。阴性对照孔只加照射的自身细胞，设3复孔。 4. 收集细胞，液闪仪计数，打印结果。 5. 计算相对反应（RR） （实验组cpm－阴性对照组cpm） RR＝ 阳性对照组cpm－阴性对照组cpm 注意事项 1. 细胞活力：使用冷冻细胞时，复苏后应检查细胞活力。 2. 培养液中添加的血清：有的血清可能会刺激或抑制反应。 3. 本底应小于2000 rpm，阳性对照组应大于20000 rpm。 应用实践 1）主要用于估计器官移植前供体与受者之间MHC相配程度； 2）也可用于移植后急性排斥反应的监测指标和HLA、H-2II类抗原的分型等研究； 3）在研究淋巴细胞功能和免疫调节中也有广泛应用。 基础理论 CTL为细胞毒性T淋巴细胞的简称。是CD8＋T细胞识别APC表面MHC I类分子递呈的肿瘤或病毒特异性抗原肽后，分化形成的。当CTL遇到相应的肿瘤细胞或病毒感染细胞时，能够通过细胞接触机制或裂解机制杀伤靶细胞。 1. 细胞接触机制 CTL表达FasL，靶细胞表达Fas，FasL与Fas的配接，通过Fas传入的信号激活靶细胞内细胞凋亡途径，导致靶细胞死亡。 2. 细胞裂解机制 CTL激活后，胞质内颗粒向2个细胞接触点移动。颗粒膜与细胞膜融合通过外吐释放颗粒内容物。穿孔素插入靶细胞膜后聚合，在细胞膜上形成孔，造成细胞裂解。颗粒酶诱导靶细胞凋亡。 5