基因工程载体人工染色体载体 201209.pptxVIP

其他载体一、人工染色体二、植物基因工程载体三、动物基因工程载体一、人工染色体 人基因组十分庞大，约含4×109bp，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）载体应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（telesome）、着丝点(centromere)及复制起点等功能序列，可插入长度达200-500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要1、酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC)酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）◆酵母人工染色体是另一类酵母穿梭载体。具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。◆ YAC可以接受100-1000 kb的外源DNA片段，这一特点使YAC成为人类基因组计划及图位克隆分离基因的重要工具，并促进了发展人类人工染色体(human artificial chromosome，HAC)的研究。 YAC载体正常酵母人工染色体含有：* 四膜虫端粒（tel)* 酵母自主复制序列（ARS)* 酵母着丝点 (CEN)* 酵母的选择标记 (TRP1、URA1)The functional elements of a yeast chromosome the capacity to clone large exogenous DNA fragments (up to 2 Mb) has made YACs a vital tool in physical mapping YAC的组成结构（1）着丝粒区（CEN）酵母染色体着丝粒区的保守序列:由三个区组成IIIIII78-86bpA A GTCACGTG T TGTTTCTGNTTTCCGAAA（2）端粒（TEL）两个端粒序列Tel。酵母端粒保守序列是(G4T2)n 重复序列。（3）复制起点（ORI）约100bp的自主复制序列（ARS）。（真核生物中只有酵母菌有ARS）（4）克隆位点位于 SUP4 基因内部。插入失活选择：SUP4酶失活的酵母菌落呈红色； 不失活的菌落是白色。142、细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome,BAC）细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC） ◆ BAC载体是基于细菌的性因子(F因子)质粒的一些特点构建的。F因子在细菌接合时转移1Mb的细菌染色体片段。将F因子经基因工程改良构成的BAC载体，可用于克隆100 kb以上的DNA片段。◆带有外源片段的BAC载体在细菌细胞中通常仅单个拷贝，这一特点有利于保持DNA大分子，在细胞内稳定复制而不发生重组。BAC载体本身分子量小，具有氯霉素抗性选择基因及多克隆位点。Structure of a bacterial artificial chromosome (BAC), used for cloning large fragments of donor DNA. CMR is a selectable marker for chloramphenicol resistance. oriS, repE, parA, and parB are F genes for replication and regulation of copy number. cosN is the cos site from l phage. HindIII and BamHI are cloning sites at which foreign DNA is inserted. The two promoters are for transcribing the inserted fragment. The NotI sites are used for cutting out the inserted fragment.3、PAC载体二、植物载体Plant cloning vectorsTi质粒:侵染广泛的双子叶植物T-DNA或T-区(T-region)：约20kb，包含专化冠瘿碱生化合成和冠瘿瘤生长的基因，随机地整合到植物染色体上。结构特点：两端具有25个碱基对的顺向重复序列，但重复不是完全的。25个碱基对的序列称为T-DNA的边界序列(T-DNA border sequence)。去除右边界序列，将使T-DNA失去转移和整合的功能；左边界的缺失，对致瘤性无明显影响。毒性区域即vir(virulence)区域:引起T-DNA转移的区域。长度约35kb，和T-DNA处于不同位置植物Ti质粒载体（1）T-