m6A甲基化检测方法和优劣势盘点——m6A专题.pdfVIP

m6A 甲基化检测方法及优劣势盘点 | m6A 专题 最早发现的 RNA 甲基化修饰包括假尿苷和5mC 等。在 mRNA 中，常见的修饰包括 m6A、m1A、5mC 等。早在上世纪 70 年代，人们已经在真核生物的 mRNA 和 lncRNA 中发现了 m6A 修饰。但是受到技术手段的限制，检测 m6A 尤其是对 m6A 进行定量，甚 至是从单碱基水平鉴定 m6A，一直进展缓慢。随着高通量测序技术（next generation sequencing, NGS）的发展以及液相色谱灵敏度的提高，科学家们在此基础上发展了多种 m6A 检测方法。 目前检测m6A 所用的技术手段包括高通量测序、比色法以及液相色谱质谱联用（LC- MS），具体方法包括 MeRIP-seq、miCLIP-seq、SCARLET、LC-MS/MS 等。下面就来 介绍目前较为主流的四种检测 m6A 的方法，其中 LC-MS/MS 和比色法能够检测 mRNA 整体的 m6A 水平，而 m6A-seq 和 miCLIP-seq 属于高通量测序手段。 1．C-MS/MS 图 1 LC-MS/MS 检测 RNA 中 m6A 水平分析流程图 LC-MS/MS 在液相质谱的基础上采用串联质谱，能够获得分子离子峰和碎片离子峰， 可对碱基同时进行定性和定量分析。如图 1 所示，第一步使用 TRIzol 提取完 Total RNA 后，既可以用 oligodT 磁珠对 mRNA 进行富集，也可以使用 rRNA 去除试剂盒获得包括 mRNA、lncRNA 等在内的 RNA。第二步使用核酸酶 P1 （Nuclease P1）将 RNA 从单链 消化成单个碱基。第三步加入碱性磷酸酶和碳酸氢铵后孵育数小时，将样本注射入液相色 谱仪，根据出峰的保留时间面积计算各个碱基的含量。第四步进入质谱串联分析，单个核 糖核苷酸会被离子化，同时被打断成五碳糖和嘧啶或嘌呤，最后根据出峰的保留时间计算 m6A 的面积。最后根据 m6A 和总腺嘌呤的比例就能算出 m6A 在 mRNA 上整体的甲基化 程度。 2 ．比色法 图 2 m6A 甲基化定量试剂盒流程展示及结果 比色法与 LC-MS/MS 比较相似，也是从整体水平上检测 RNA 上 m6A 甲基化水平。 相对于 LC-MS/MS 较为繁琐的操作，比色法更为简便。研究人员既可以提取 total RNA，也可以利用oligodT 磁珠富集 mRNA。Epigentek 公司推出的这款名为 EpiQuik M6A RNA Methylation Quantification Kit 试剂盒其核心原理与 ELISA 反应类似，经过 优化后检测 m6A 灵敏度会更高。 3．m6A-seq 图 3 MeRIP-seq （m6A-seq）与 miCLIP-seq 实验流程 2012 年之前，几乎没有从全基因组或全转录组水平上鉴定 m6A 修饰的文章。之后两 篇独立发表的论文第一次从转录水平上，大范围、高通量地鉴定了人和小鼠 m6A 的甲基 化水平。这种方法被称为 MeRIP-seq 或 m6A-seq。 如图 3 所示，第一步先对 mRNA 进行片段化，接下来使用带有 m6A 抗体的免疫磁珠 对发生 m6A 甲基化的mRNA 片段进行富集，然后将富集到的 mRNA 片段纯化后构建高 通量测序文库进行上机测序。另外需要单独构建一个普通的转录组文库作为对照。最后将 2 个测序文库放在一起进行生物信息学分析，得到 m6A 甲基化程度较高的区域，也叫做 m6A peak。 这种方法优点是方便快捷成本低廉，可以对发生高甲基化的 mRNA 区域进行一个定 性分析。但是 MeRIP-seq 只能鉴定 m6A 高甲基化的区域，并不能做到单碱基的分辨 9 率。送样要求建议为肝脏、脑等转录较为活跃的组织，如果细胞样本建议 1x10 的细胞量 （约为8 板细胞以上）。最后总 RNA 含量推荐在 800ug 以上，mRNA 富集在 10-30ug 以上才会进入下游实验。 4 ．miCLIP-seq 已知 miCLIP-seq 等方法能够对 m6A 做到单碱基的分辨率。这种方法也会用到 m6A 抗体，但是会使用紫外交联的方法进行免疫共沉淀。 如上图 3 所示，第一步依旧是对富集完