人γδt细胞杀伤结核分枝杆菌感染thp-1细胞的研究-study on killing thp - 1 cells infected with mycobacterium tuberculosis by human γ δ t cells.docx

人γδ T 细胞杀伤结核分枝杆菌感染 THP-1 细胞的研究?中 文 摘 要研究背景：结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染引起的, 目前仍是发病率和病死率最高的传染病之一。Mtb寄生在巨噬细胞内，主要引起细 胞介导的免疫应答。 γδ T细胞是与αβ T细胞在许多方面有不同特征的独特的一类T 细胞，在抗结核感染免疫中可能发挥重要作用。已知γδ T细胞可通过释放细胞因子 如IFN-γ激活巨噬细胞对Μtb的吞噬杀伤活性，还发现γδ T细胞还可直接杀伤被Mtb 感染的巨噬细胞，这在γδ T细胞参与抗结核感染的免疫保护作用中可能有重要意 义，但有关人γδ T细胞杀伤Mtb感染巨噬细胞的具体机理有待进一步探讨。 目的：建立流式细胞术检测单核巨噬细胞吞噬荧光素标记 Mtb 的方法；建立 Mtb 感染巨噬细胞模型；流式细胞术检测人γδ T 细胞对 Mtb 感染的巨噬细胞的细胞毒 活性；观察 IL-15 对人γδ T 细胞杀伤 Mtb 感染巨噬细胞的影响。 方法：用苏通氏液体培养基培养 Mtb H37Ra，制备 Mtb 菌悬液，用不同浓度荧光 素(FITC)标记 Mtb，流式细胞术检测 FITC 对 Mtb 的标记率。FITC 标记的 Mtb 与 人外周血单核细胞和佛波醇酯(PMA)激活分化的 THP-1 细胞(巨噬细胞)，共孵育不 同时间后，或 FITC 标记的 Mtb 与巨噬细胞以不同比例共孵育 1 h 或 2 h 后，用流 式细胞术检测 FITC 阳性的单核细胞和巨噬细胞的数值，计算对 Mtb 的吞噬率； Mtb 以 10∶1 的比例感染巨噬细胞 18 h，以流式细胞术、抗酸染色和激光共聚焦显 微镜来观察感染模型的建立。流式细胞术检测 PMA 分化前后和 Mtb 感染后 THP-1 细胞表面 CD14 表达的变化。用 Mtb-Ag 刺激培养人外周血单个核细胞(PBMC)， 优势扩增γδ T 细胞，流式细胞仪检测 Mtb 抗原活化的 T 细胞?(MtbAT)中的γδ T 细胞 百分率，大于 85% 时，作为效应细胞用于γδ T 细胞对 Mtb 感染巨噬细胞的细胞毒 活性实验。用不同浓度羧基荧光素二醋酸盐酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记 Mtb 感染 的巨噬细胞，作为靶细胞。将效应细胞与靶细胞以不同比例共孵育 4 h，用碘化丙 啶(PI)染色后用流式细胞仪检测检测 CSFE 和 PI 双阳性细胞为杀伤的靶细胞，计算 γδ T 细胞对 Mtb 感染巨细胞的细胞毒活性；并检测 IL-15 作用γδ T 细胞 24 h 后， γδ T 细胞对 Mtb 感染巨噬细胞的细胞毒活性的影响。?本论文研究受安徽省教育厅省高校省级重点实验室重点科研项目(2004sys008)资助结果：1. FITC(50 μg/ml)与 Mtb 作用 2 h 时对 Mtb 的标记率达 92%。人单核细胞对 FITC 标记 Mtb 的吞噬率从孵育时间 10 min 时的 35%增加至 120 min 的 80%。巨噬 细胞对 FITC-Mtb 的吞噬率从 1 h 的 30%增加至 6 h 的 81%。未加台盼蓝淬灭时， 单核细胞在 10 min 和 120 min 对 FITC-Mtb 的吞噬率与加台盼蓝淬灭相比，分 别增加 29%和 6%；巨噬细胞在 1 h 和 6 h 对 FITC-Mtb 的吞噬率与加台盼蓝淬 灭相比分别增加 1%和 7%。2. 巨噬细胞与 FITC-Mtb 共孵育 1 h 时，巨噬细胞与 Mtb 比例从 1∶1 增加至 1∶100，其吞噬率则从 6.5%增加至 85.1%，巨噬细胞与 FITC-Mtb 共孵育 2 h 时， 巨噬细胞与 Mtb 比例从 1∶1 增加至 1∶100，其吞噬率则从 12.8%增加至 89.9%。3. THP-1细胞表达CD14的阳性率为4.5%，PMA作用后，CD14阳性率为22.3%，差 异显著(P0.01)。Mtb感染后，CD14阳性率增加至27.5%，差异显著(P0.01)。 4. 人γδ T 细胞与 THP-1 细胞以 1∶1 至 50∶1 的比例作用 4 h 后，γδ T 细胞对 THP-1 细胞的细胞毒活性从 16.1%增加至 47.2%，人γδ T 细胞与 Mtb 感染的巨噬细胞 以 1∶1 至 50∶1 的比例作用 4 h 后，γδ T 细胞对 Mtb 感染的巨噬细胞的细胞毒 活性从 22.5%增加至 80.7%。5. 人γδ T 细胞与 IL-15 共孵育 24 h 后与 Mtb 感染的巨噬细胞以 10∶1 的比例作用4 h，γδ T 细胞对 Mtb 感染的巨噬细胞的细胞毒活性为 64.1%，高于无 IL-15 刺 激的 46.8%，差异