酶表面修饰.pptVIP

②光敏试剂。 ③与过甲酸反应。 ④与碘代乙酰胺反应。 (7)二硫键的化学修饰 ①2—·巯基乙醇修饰 ② ③二硫苏糖醇(DTT)修饰 （8）酚基的化学修饰 ①N—乙酰咪唑修饰 ②碘化反应 ③四硝基甲烷反应 ④偶氮化反应 ⑤二异丙基氟磷酸(DFPA)修饰 (9)胍基的化学修饰 ①丁二酮修饰 ②1，2—环己二酮修饰 ③苯乙二醛修饰 2.2 酶化学修饰的条件 修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高.这样，谨慎选择修饰反应条件是很需要的。当然，这些修饰条件随着修饰反应的不同而不同，因此，需要经过大量实验才能确定. 2.2.1 PH与离子强度 pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。例如：在pH2—5时，碘乙酸可以选择性地与Met的侧链基团发生修饰反应，而在此pH条件下，可被碘乙酸修饰的基团，如巯基、咪唑基和氨基等，都处于非反应的状态。另一方面，有些修饰试剂在不同pH条件下与同一基团可形成不同产物。例如：1，2—环己二酮在pH8—9时，与L—Arg生成N7，N8—(1，2—二羟基环已—1，2—烯)—L—Arg；促在pH11时，其产物主要是N—(1—羟基—5—氧代—2，4—二氮杂双环—4—菲2—内翁烯)—L—鸟氨酸。 2.2.2修饰反应的温度与时间 严格控制温度和时间可以减少以至消除—些非专——性的修饰反应。比如：用聚乳糖作修饰别表面修饰酶(还原剂为氢硼化氰，BH3CN)时．在8℃时10d内几乎无反应．而当温度从25℃上升到37℃时反应速度加快了3倍，而且随pH的升高而加快；又如：用甲酸氧化酶蛋白的反应，在低温(约—10℃)下修饰反应仅限于Cys、胱氨酸和Met残基上，而在较高温度下，甲酸可以与Trp、Tyr、Ser、 Scr以及Thr残基发生反应。 2.2.3反应体系中酶与修饰剂的比例 例如：用聚乙二醇(PEG)修饰酶时，活化PEG的多少能控制酶分子的修饰程度。一般地说、当活化PEG与酶的反应配比为15—50：1(mol比)时，修饰后酶活力为15％．最多达40%。 2.3酶蛋白修饰反应的主要类型 化学修饰剂与酶蛋白反应的类型归纳起来主要有如下几种： 2.3.1酯化及相关反应 酯化及相关反应， 主要的修饰试剂包括乙酰眯唑、二异丙基氟磷酸(DFPA)、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯、O—甲基异脲。 它们在室温(20—25℃)、pH4.5—9.0条件下， 主要与酶蛋白中的氨基、羟基、酚基及巯基等侧链基团发生酰基化反应： 2.3.2烷基化反应 这类修饰剂主要有2，4—二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、碘甲烷、苯甲酰卤代物等，通常带有一个活泼的负电性的卤素原子，使烷基带有部分正电性，导致酶蛋白亲核基团烷基化。常被修饰的基团有氨基、巯基、羧基、甲硫基、咪唑基等。 2.3.3氧化还原反应 这类修饰试剂有H2O2、N—溴代琥珀酰亚胺等；另外一类是光氧化试剂。它们都具有氧化性，能将侧链基团氧化。受氧化的侧链基团有巯基、甲硫基、吲哚基和酚基等。还原剂有2—巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇(DTT)等。它们主要作用于二硫键。连四硫酸钠、连四硫酸钾作为氧化剂作用温和，同时，在修饰反应中用作巯基保护剂。例如： 2.3.4芳香环取代反应[四硝基甲烷(Tetranitro—Methane，TNM)反应] ： 由于蛋白质中氨基酸残基上的酚羟基在3和5位上容易发生亲电取代的碘化和硝代反应，其中四硝基甲烷是这类修饰剂中的典型例子．它作用于Tyr残基的酚羟基后，形成3—硝基酪氨酸衍生物。其产物具有特殊光谱。 2.3.5溴化氰[BrCN)裂解反应 BrCN裂解Met反应可在自发诱导重排条件下导致肽键断裂： 3 酶蛋白肽链的大分子修饰 对酶蛋白肽链的大分子修饰反应，耍注意的问题是修饰剂分子量大小、链的长度。一般要求修饰剂具有较大的分子量、良好的生物相容性和水溶性。这样，经修饰的酶，其半衰期较长，活力回收较高。下面将介绍—些主要的修饰剂和修饰反应。 3.1聚乙二醇及其修饰反应 聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）[HO—CH2—CH2—O—CH2—CH2—OH]n。它是线性分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性．使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。被修饰的酶分子被盖上一层疏松的亲水外壳，导致流体动力学发生改变，从而产生了许多有用的性质，比如：修饰酶能在广泛的pH范围溶解；不被离子交换剂吸附；电泳迁移率下降；沉降速度[较天然酶)慢等。聚乙二醇用作修饰剂时应注意下面几个问题： (1)PEG分子量为750一5000的修饰效果较好