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mRNA的提取及分离纯化方法 生物化工 卢余盛 主要内容 一、mRNA的结构特征及生理功能 二、体外分离提取mRNA的意义 三、总RNA分离的分离提取 四、 mRNA的分离纯化 五、结果分析 mRNA的结构特征及生理功能 mRNA是在细胞核中形成后转移到细胞质中，将从DNA分子上转录的遗传信息带到核糖体上，作为合成蛋白质的指令，故称信使RNA。 mRNA占细胞RNA总量的1％～5％。mRNA种类很多，哺乳类动物细胞总计有几万种不同的mRNA。mRNA的分子大小变异非常大，小到几百个核苷酸，大到近2万个核苷酸，沉降系数在8s～30s之间 。mRNA一般都不稳定，代谢活跃，更新迅速，寿命较短。 真核生物 mRNA的结构很特殊，即5’-末端有帽子结构 ，3’-端绝大多数均带有多聚腺苷酸尾巴，其长度为20～200个腺苷酸。 体外分离提取mRNA的意义 真核生物DNA的结构包括编码区和非编码区，而编码区是不连续的，又分为外显子和内含子，外显子能够转录mRNA,编码出蛋白质，而内含子则不可以。所以要想更深一步研究DNA在遗传表达以及控制生命活性中的作用，就必须弄清DNA控制蛋白质合成的有义序列即外显子序列。 从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链,将双链cDNA和载体连接,然后转化扩增, 即可获得cDNA文库，构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。cDNA的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段 ，模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率 。 （一）、总RNA的提取 1、 TRIzol法 TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。 TRIzol法提取流程 1 ． 样品处理： （１）培养细胞：收获细胞 1-5×10 7 ，移入 1.5ml 离心管中，加入 1ml Trizol ，混匀，室温静置 5min 。 （２）组织：取 50-100mg 组织（新鲜或 -70 ℃ 及液氮中保存的组织均可）置 1.5ml 离心管中，加入 1ml Trizol 充分匀浆，室温静置５ min 。 2 ．加入 0.2ml 氯仿，振荡 15s ，静置 2min 。 3 ． 4 ℃ 离心， 12000g × 15min ，取上清。 4 ．加入 0.5ml 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置 10min 。 5 ． 4 ℃ 离心， 12000g × 10min ，弃上清。 6 ．加入 1ml 75% 乙醇，轻轻洗涤沉淀。 4 ℃ ， 7500g × 5min ，弃上清。 7.? 晾干，加入适量的 DEPC H 2 O 溶解（ 65 ℃ 促溶 10-15min ）。 试验流程图 2、 苯酚法 细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate,SDS）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧裂振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界面处形成凝胶层。 苯酚法提取酵母RNA  取1g 活性干酵母在研钵中研碎，加10mL SDS-缓冲液使成匀浆，洗入各Ep管（略少于管容积的一半），加溶菌酶0.1mL，混匀，室温静置10min，再加等体积饱和酚液，室温下剧烈振荡5min。置冰浴中分层，在0-4℃低温环境下，10000r/min 离心10min。吸出上层清液，转入新的Ep 管，加等体积氯仿-异戊醇，室温下剧烈振荡2.5min，然后10000r/min 离心5min。吸出上层清液，转入另一新Ep 管，加2 倍体积95％乙醇（含2％乙酸钾），在冰浴中放置30min，使RNA 沉淀。再以10 000r/min 离心5min，弃上清液，沉淀用少许无水乙醇和乙醚各洗一次，即加乙醇或乙醚，迅速离心各1min，保留沉淀。倾去乙醚后，减压真空干燥，准确称重，记录。 3、异硫氰酸胍—酚法 异硫氰酸胍—酚法提取RNA的原理如下：GIT与β－巯基乙