大黄鱼Rac基因cDNA全长克隆及分析.pptVIP

大黄鱼Rac基因cDNA全长克隆及分析 主要内容 研究背景与意义 技术路线 结果与分析 结论 致谢语 研究背景与意义 1、Rac蛋白是小分子GTP结合蛋白Ras超家族中最大的亚家族。 2、Rac在囊泡运输中发挥着调节作用。 3、近来发现, Rac与细胞的吞噬作用有关，是一种免疫相关因子，本实验期望克隆大黄鱼Rac基因序列，为以后进一步研究与分析奠定基础。 技术路线 结果及分析 2、cDNA模板检测结果 5、 3’RACE第一轮PCR结果 6、3’RACE第二轮PCR 7、3’RACE克隆产物的鉴定结果 8、 5’RACE第一轮PCR结果 9、5’RACE第二轮PCR 结果 10、 5’RACE克隆产物的鉴定 致谢语 感谢韩芳老师在整个毕业论文设计过程中给予的悉心指导，感谢她对我孜孜不倦的教诲！ 同时感谢课题组的全体老师和同学给予的鼓励和无私的帮助！ * * * 大黄鱼属于硬骨鱼纲鲈形目石首鱼科黄鱼属,又名黄花鱼、黄瓜鱼、大黄花鱼，是我国特有的经济鱼种，也是福建省的主要养殖种类。 随着养殖规模扩大、世代增加，病害问题越来越趋严重，给养殖业造成了巨大的经济损失，阻碍了大黄鱼养殖业的持续发展。因此，从其自身的抗病力入手，提高鱼体自身的免疫力来抵抗病原微生物的侵袭是一个很好的途径。 拼接cDNA全长 分析 提取肌肉组织总RNA 逆转录成cDNA 保守区扩增 3’RACE扩增 5’RACE扩增 分析查找序列 设计引物 1、肌肉总RNA的提取结果 图1 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测大黄鱼肌肉总RNA RNA条带清晰，表明RNA无明显降解， 可用于逆转录cDNA。 在200-300bp之间有一条明显条带而阴性对照未扩增出条带，证明反转录反应成功，cDNA模板可用。 图2 通过扩增β-actin基因检测cDNA M：DNA Marker； 1：特异性扩增； 2：以水做模板的阴性对照 M 1 2 图3 凝胶电泳检测保守区扩增产物 M：DNA Marker； 1：以水作为模板的阴性对照； 2：特异性扩增 可看到一条约530bp的条带，条带较清晰，而阴性对照无条带。表明扩增得到的条带可能就是所需条带，将琼脂糖块回收做后续实验。 3、保守区扩增结果 M 1 2 产物回收 产物与载体的连接 转化 初筛重组子 图4 凝胶电泳检测菌落PCR产物 M：DNA Marker； 1：以水作为模板的阴性对照； 2:以PCR产物为模板的阳性对照； 3-6：菌落PCR 4、PCR筛选克隆子结果 M 1 2 3 4 5 6 随机挑4个克隆子均含有约530bp的目的条带，都为阳性克隆 图6 凝胶电泳检测3ˊRACE第一轮反应产物 M：DNA Marker； 1：第一轮反应产物； 第一轮扩增得到一条较亮的1100bp左右的条带，阴性对照无条带. 图7 凝胶电泳检测3ˊRACE第二轮反应产物 M：DNA Marker； 1：第二轮产物 第二轮扩增得到一条大小介于250-500bp之间的条带，与目的条带预期大小基本相符，阴性对照无条带，表明该片段可能就是所需片段，将琼脂糖块回收做后续实验。 图8 凝胶电泳检测菌落PCR产物 M：DNA Marker； 1：以水作为模板的阴性对照； 2：第二轮PCR产物为阳性对照； 3-4：菌落PCR扩增产物 两个菌落均含有目的条带 图10 凝胶电泳检测5ˊRACE第一轮反应产物 M：DNA Marker； 1：第一轮反应产物； 2：阴性对照 第一轮扩增产生100-400bp的拖带，但还没有明显条带 图11 凝胶电泳检测5ˊRACE第二轮反应产物 M：DNA Marker； 1：以水作为模板的阴性对照； 2：第二轮PCR产物 经第二轮扩增,在300bp左右处有特异性条带出现并且阴性对照无条带 产物回收 产物与载体的连接 转化 初筛重组子 图12 凝胶电泳检测菌落PCR产物 M：DNA ladder； 1：以水作为模板的阴性对照； 2：以第二轮PCR产物为