微分干涉DIC显微成像.PPT

* 共聚焦显微镜已经被广泛应用于生物荧光相关研究 对于一般的薄组织片成像( 20~ 50um) 共聚焦也具有一定的优势 共聚焦显微镜完美吗？ 存在的问题： 扫描深度？？ 光漂白？？ 紫外激发？？ 空间分辨率？？ 一般 80um 严重 几乎整个Z轴都受光 紫外光对生物样品损伤大 受到衍射极限的限制 4.2 激光显微成像-FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer: enables measurements of molecular association/dissociation and lengths Laser excitation 条件： 应用： 特性： 4.2 激光显微成像-FLIM Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy 周围环境参数传感 “lifetime” 探针 4.2 激光显微成像-拉曼共聚焦显微成像 PMT 高光谱分辨率 高灵敏度 低波数拉曼谱线 基底光谱去除技术： 1、算法；2、测试 4.3 非线性光学显微成像 -多光子荧光扫描显微成像 共聚焦显微镜存在的问题： 存在的问题： 扫描深度？？ 光漂白？？ 紫外激发？？ 空间分辨率？？ 一般 80um 严重 几乎整个Z轴都受光 紫外光对生物样品损伤大 受到衍射极限的限制 absorb one photon about half energy (=double frequency) absorb two photons at once Fluorescence Fluorescence Excitation light Excitation Light Ground state Excitation state 1 photon 2 photon 多光子吸收/荧光 吸收双光子的几率和吸收单光子产生荧光的比例约为 1 : 100.000.000 需要能够在瞬间将光子集中发射的设备 高峰值功率、短脉冲的红外激光 + 高NA物镜 （飞秒）双光子激发光的一般特点 红外超短脉冲激光：~ 100 fs 脉冲频率：80 – 90 MHz 峰值功率高： 可达500 kW 波长可调谐 (700 – 1000nm)：可激发波长约为单光子的两倍，可以激发纯紫外染料 飞秒激光器 100fs 500kW 1秒 = 103毫秒 = 106微秒 = 109纳秒 = 1012皮秒 = 1015飞秒 700-1020 nm tunable 100fs, 80MHz, 4W (ave) 12.5ns 双光子扫描显微镜的显著特点（1） 扫描深度： 300 ~ 800 um Neuron Image in depth 800mm Surface FV-2P Images 400mm Cerebellum/Purkinje Cerebral cortex Astroglia Cerebral cortex Blood vessels 单光子共聚焦 80um 生物组织对红外光光吸收少 随深度增加衰减小 Excitation Ti:Sapphire fs laser 2-Photon 激发 – 高光子密度的部分只集中于焦点位置 双光子扫描显微镜的显著特点（2） 焦点以外部分几乎没有激发，所以焦点外光损伤小 2-Photon 激发 – 高光子密度的部分只集中于焦点位置 激光刺激和漂白只在焦点位置或焦平面，无需使用pinhole Single Photon Multi Photon Sample Excitation area Illumination (A) (B) （基于钛宝石飞秒激光的）双光子激发波长范围非常大(700 – 1000nm)：可激发波长约为单光子的两倍，可以激发纯紫外染料，且生物损伤小 基本上满足： λ双光子 = 2 X λ单光子 时能够激发荧光 CFP EGFP YFP DsRed 双光子扫描显微镜的显著特点（3） 　 　　 ? 和荧光波长距离远，波长容易分离 荧光波长 单光子激发 690～1040nm 双光子扫描显微镜的显著特点（4） 多光子激发 荧光波长 商用钛宝石飞秒激光器价格昂贵 Ti：Sapphire-Laser比单光子激光的稳定性略低 　　?不同个体之间有差异：光斑形状、光斑稳定性、输出功率、束宽、光束发散、散光差异等。 环境温度要求高 　　?24h运转，恒定在18℃左右、湿度低于 50%等。 950nm附近的红外激光经常在高湿度环境中产生激光下跌现象 激光安全等级为Class 4 　　?Class4 Laser : be c