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造血干细胞移植治疗大鼠脑梗死实验研究 　　【摘要】目的：探索造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSCs)移植治疗大鼠脑梗死的可行性及效果。方法：根据改良的Longa线栓法建立大鼠脑栓塞模型,随机分为两组: HSCs治疗组、对照组。模型制作成功后7d, HSCs治疗组定向植入Brdu标记的1 ×10?6 个HSCs;对照组植入等量的PBS液。在移植前及移植后1、2、3、4周进行NSS评分;移植后1、4周用免疫组化方法观察梗死侧半球Brdu /CD34、Brdu /Nestin、Brdu /Nse、Brdu /vWF、VEGF、vWF的分布情况;第4周TCC染色观察梗死体积变化。结果：HSCs组梗死侧半球有大量的Brdu /CD34、Brdu /Nestin、Br2du /Nse、Brdu /vWF双染阳性细胞;较对照组VEGF表达增强、vWF密度增加,神经功能改善明显,梗死体积缩小。结论：外源性HSCs在局灶性脑梗死大鼠脑内能够存活,分化为神经干细胞、神经元细胞,促进血管新生,改善神经功能,缩小梗死体积。 　　【关键词】造血干细胞; 移植; SD大鼠; 脑梗死; 大脑中动脉闭塞 　　【中图分类号】R213.3 【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)08-0008-03 　　 　　急性脑梗死的超早期溶栓治疗若能适时恢复血流可使神经细胞免于缺血损害而使患者得到康复。神经细胞不能再生,那么错过溶栓最佳时机或因种种原因不可接受溶栓治疗,大部分将遗留严重的功能障碍,虽经康复治疗亦不能痊愈,因此脑梗死患者的治疗仍是一个难题。干细胞是人类整个生命期中都有自我更新能力的细胞,在合适的条件下,可以分化构建成机体的各种细胞,这为治疗困扰人类健康的脑血管疾病提供了机会。HSCs存在于骨髓和外周的具有高度自我更新和多向分化潜能的造血前体细胞,具有分布广泛、来源非富、获得容易、免疫排斥小等优势,是移植治疗较好的干细胞来源。目前,HSCs移植特别是外源性移植治疗脑卒中方面的研究还比较少,缺乏大量、系统的实验数据。本研究通过对动物模型梗死灶周边HSCs的移植,观察移植HSCs的存活、分化情况以及对神经功能的影响。 　　1 资料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 实验动物：选用健康近交系清洁级成年SD大鼠100只,雄性,体重300±20克,由齐齐哈尔医学院实验动物中心提供。 　　1.1.2 主要材料：重组人粒细胞集落刺激因子(rhG2CSF)购于厦门特宝医药有限公司;大鼠干细胞分离液购于天津灏洋生物有限公司;B rdu、抗大鼠Brdu单抗、抗大鼠CD34单抗体、兔抗巢蛋白多克隆抗体、抗大鼠vWF单抗、抗大鼠VEGF单抗、免疫组化双染试剂盒均购于美国SANTA CRUZ公司。 　　1.2 HSCs的分离、标记 　　1.2.1 骨髓干细胞动员：10只大鼠皮下注射rhG2CSF首次按20g/kg,以后每天10μg/kg,共5d。第6天心脏采集抗凝血。 　　1.2.2 HSCs分离：取新鲜抗凝血,与HanKs液1∶1混匀后,小心加于2倍的大鼠造血干细胞分离液面上,在20℃下以1500转/分离心,离心后细胞分为4层,用1ml吸管收集第二层的环状乳白色干细胞层,放入含HanKs液5ml的离心管中,以1500转/分离心10min,吸上清液,加入4ml的PBS液,吹打成细胞悬液,1500转/分离心10min,沉淀经PBS液反复洗两次收集,备用。 　　1.2.3 免疫细胞化学鉴定CD34细胞：将细胞悬液浓度调节到106/ml左右,取少许涂于防脱玻片上。风燥后用冷丙酮固定8min,按两步法免疫组化检测CD34抗原。 　　1.2.4 细胞标记：将采集干细胞放入含10μmol/L B rdu的RPM I1640完全培养液中,将培养瓶放入37℃、5%CO2 培养箱中孵育。48h后取出放入离心管中离心(1500转/分)弃培养液,将沉淀物用PBS液洗涤两次,免疫细胞化学法检测细胞Brdu标记率。 　　1.3 脑梗死动物模型制作：根据longa线栓法 　　建立大脑中动脉脑栓塞模型,大鼠清醒后2h采用longa［1］的评分方法。0与4分的动物弃之不用。 　　1.4 分组：动物模型制作成功后7d,将大鼠随机分为两组:HSCs治疗组、对照组,每组40只。 　　1.5 HSCs移植：0.4%台盼篮检测HSCs细胞的活性率。大鼠麻醉成功后,取头部正中切口,暴露前囟。选取注射位点［2］：前囟后方1.2mm,中线向右旁开3mm,硬膜下4mm。HSCs移植组:缓慢注入标记B rdu的1 ×10?6 个HSCs;对照组:给予等量PBS液，注射时间超过5min，留针5min后缓慢拔针，缝合头皮。 　　1.6 观察指标