第五章---基因重组和转移.ppt

用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。 3. 制备原理 4. 制备过程 培养大肠杆菌 OD600至0.4-0.6 On ice 5-10 min 4℃离心收集菌 用冰冷的10mMCaCl2重悬 4℃离心收集菌 4℃离心收集菌 分装、-70 ℃冻存 用冰冷的10mMCaCl2重悬 On ice 30 min 用冰冷的含15%甘油的10mMCaCl2重悬 二、重组DNA导入大肠杆菌 （1）转化（transformation) 指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。（即大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。） （2）转染（transfection) 采用与质粒DNA转化受体细胞相似的方法，将重组λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞的过程。（即大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。） 1. 外源DNA导入细菌的几种方法 （3）转导（transduction) 指通过λ噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到宿主细胞的过程。 （借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。） 每?gDNA转化成功的细菌克隆数。 3. 转化方法 2. 转化率 简单，但转化效率不高（106-108/?gDNA）。 （1）热休克法（heat shock） 转化效率高（高于109/?gDNA）。 （2）电转化法 10ng载体DNA 100?L感受态菌 On ice混合，静置30分钟 42oC 1分钟 加入1mL LB培养基 37℃慢摇 1小时 10-100?L转化液涂含抗菌素的平板 吸附DNA 摄入DNA (1)热休克法 LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6 冰浴15分钟，2°C离心集菌 冰冷的水重悬菌体 2°C离心收集菌体 冰冷的水重悬菌体 2°C离心收集菌体 少量冰冷的水重悬 分装成 50-300?L 电转仪调为2.5kV,25?F 脉冲控制器200-400? 0.5?g质粒DNA On ice混合 加入1mLSOC培养液 37°C中速震荡60分钟 10-100?L转化液涂含抗菌素的平板 转化 （2）电转化法 4. 平板培养基培养细菌 10-100?L转化液 涂于含抗菌素的平板 37℃过夜 环形重组质粒 质粒自我连接 线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。 ①环形质粒数 （1）重组质粒 5. 影响转化率的因素 ①生长状态 必须使用对数生长期的菌。 ②必须在冰冷的条件下制备。 要充分 ④储存感受态菌要在-70℃以下 ③CaCl2处理 ⑤使用感受态菌时必须迅速融化 融化后一般不能再次冻存使用。 （2）感受态细胞 （competent cells) 6. 体外包装的噬菌体的转导 （1）体外包装（in vitro packaging） （2）转导（transduction） 通过受体菌细胞表面的?DNA接受器位点（receptor site)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。 体外包装过程 外源DNA 载体DNA 重组分子 原核细胞 真核细胞 扩增或表达 表达 连接 转化或转导 电穿孔或显微注射 受体细胞 第六章 基因的重组与转移 一、互补粘性末端的连接 载体与目的基因混合后， DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。 第一节 DNA片段的体外连接 依靠粘性末端 ligase nick 二、齐平末端（blunt end）的连接 5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。 1. 直接连接 T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ -OH -OH -P -P P- P- HO- HO- 5’ 3’ -OH -P P- HO- 5’ 3’ （1）同聚加尾 法 2. 人工加尾形成 “粘性末端” DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。 ①原理： 分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。 ②加尾—碱基互补 ④缺点： ③优点： 能把任何片段连接起来 不能把插入片段再切下来。 非酶切位点 用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。 （2）衔接物(linker)连接 ① linker 用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。 GGAATTCC CCTTAAGG EcoRI linker： ② linker的作用 ④缺点： 1）可以用内切酶把插入片段切下来。 如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段 2）能给载体连接上Polylinker: ③优点： （3）DNA接头 (adapter)连接法 1978年康奈尔大学的吴瑞教授发明。 5‘p-GATCCCGG-OH3’