医学课件ELISPOT技术在乙型肝炎病毒（HBV）感染研究中的应用.ppt

ELISPOT技术在乙型肝炎病毒（HBV）感染研究中的应用 首都医科大学附属北京佑安医院 闫惠平 研究员，博士生导师 乙肝病毒携带者的流行分布 HBV 携带者地理分布与肝细胞癌(HCC)发病率 HBV感染的流行情况及其严重性 HBV infection HBV实验室诊断 ELISPOT---细胞免疫学技术 从单细胞水平检测分泌抗体的细胞或分泌细胞因子的细胞, 从单细胞水平评价机体的细胞免疫或体液免疫功能 不仅适用于特异性T细胞应答的检测 也可用于特异性B细胞应答的分析 ELISPOT技术的应用 ELISPOT--在HBV细胞免疫中的应用 乙 肝 病 毒 佑安医院初步研究 研究目的 通过观察乙型肝炎病毒（HBV）特异性多肽刺激外周血单个核细胞（PBMC）产生IFN-γ的能力，分析慢性乙型肝炎患者、慢性乙型重型肝炎患者及隐性感染者体内特异性T细胞免疫应答的差异和作用。 材料和方法 病例分组 慢性乙型肝炎组（CHB）20例 慢性乙型重型肝炎组（CSH）10例 正常对照组1（N1，隐性HBV感染者）6例 正常对照组2（N2，正常献血员） 10例 研究方法 合成四条HLA-A2限制的HBV特异CTL抗原表位肽作为刺激抗原。 表面抗原蛋白Te28-39（简称Te1） 表面抗原蛋白Te183-191（简称Te2） 多聚酶蛋白Tp573-581（简称Tp） 核心抗原蛋白Tc18-27（简称Tc） 采用酶联免疫斑点（ELISPOT）技术检测抗原表位特异性T细胞的免疫应答功能。 结果1：HLA-A2基因表型检测结果 结果2：抗原特异性CTL应答功能检测结果及分析 抗原特异性CTL对肽的反应结果 只要对任何一条肽刺激产生IFN-γ的阳性斑点者即计为反应阳性者。 CHB组，阳性率为50%（10/20） CSH组，阳性率为10%（1/10） N1组， 阳性率为83.3%（5/6） N2组， 阳性率为10%（1/10） N1组对肽反应的阳性率显著高于CSH组(P=0.008)和N2组(P=0.008) 。 HBV特异性抗原表位肽在组内的应答差异 HBV特异性抗原肽平均反应强度的比较结果 抗原特异性CTL应答功能结果分析 HBV隐性感染者特异性免疫应答能力强于CHB组和CSH组，尤其是HBsAg肽在HBV清除后依然可使机体产生很强的细胞免疫反应。这可能是其能够依靠自身免疫功能清除病毒的主要原因。 慢性乙型肝炎患者细胞免疫应答较弱，而慢性乙型重型肝炎患者这种应答反应更是缺乏。表明患者很难依靠自身的免疫能力清除体内感染的病毒。 ELISPOT方法体外检测T细胞产生IFN-γ的能力有可能作为判断机体抗病毒能力的细胞免疫指标。 乙型肝炎患者HBcAg特异性细胞毒性T细胞的检测及其与临床疾病状态的关系 研究对象： HLA-A24阳性患者：急性乙型肝炎 7例 慢性乙型肝炎 13例 HLA-A24阴性患者： 急性乙型肝炎 6例 慢性乙型肝炎 17例 PBMC用HLA*2402HBV肽链四聚体复合体染色 流式细胞仪检测HBV特异性CTL细胞, ELISPOT技术检测部分患者的CTL细胞分泌IFN-γ的水平。 结果: 在7例急性乙型肝炎的急性期,-----高水平的HBV特异性的CTL细胞, 急性乙型肝炎的恢复期,HBcAg特异性CTL细胞的水平可以明显下降， 13例慢性乙型肝炎患者中,除了1例慢性肝炎急性暴发患者之外,均不能检测到HBcAg特异性CTL细胞IFN－γ的分泌。 结论：急性肝炎患者中的PBMC中有高水平的HBV特异性CTL细胞,这些细胞可能与控制乙型肝炎病毒的复制及病毒的清除有关。 乙型肝炎患者特异性细胞免疫功能 检测的初步研究 研究目的　通过酶联免疫斑点法检测乙型肝炎患者特异性细胞免疫功能,初步研究各型乙肝患者特异性细胞免疫功能的差异。 赫兢，辛绍杰等，中华实验和临床病毒学杂志,2006 , 20 (1 ):33-35 材料和方法 病例分组（每组4例） 急性乙型肝炎组 慢性乙型肝炎组 肝炎肝硬化（乙型） 乙肝病毒 (HBV) 既往感染 接种乙肝疫苗后血清乙肝病毒学标志中