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2017基因工程选考复习 基因工程农药 　　美国一家公司把Bt毒素基因，转移到假单胞菌中，生产出两种基因工程农药，将其喷洒到农作物上，害虫吸入便死亡。科学家们把Bt的杀虫毒素基因导入寄生在水稻植株组织中的一种细菌———脓杆菌中，再将获得的重组细菌利用高压封入玉米和水稻的种子内。随着作物的生长，重组菌在植株组织内增殖，害虫在咬食植物时也将这些细菌吞下，从而被杀死。该公司称这种微生物制剂为“植物疫苗”。 任务1 写出培养“植物疫苗”基本步骤 案例 序列未知：1、基因文库法 基因组文库： 部分基因文库 含有一种生物的全部基因 含有一种生物的部分基因 一、获取目的基因(Bt毒素基因) 写出获取目的基因的方法，使用何种工具 任务2 工具——限制性（核酸）内切酶（限制酶） 一种酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割磷酸二酯键。 （3）特点： （1）来源：主要是微生物，能将外来的DNA切断，是在DNA分子内部进行的。 （2）作用：切割外源DNA，使之失效，保护自身 专一性 限制性内切酶EcoRI的酶切位点及酶切产物连接 回纹序列 限制性内切酶SmaI的识别及酶切位点 平齐末端 基因组文库 使用与切割载体相同的限制酶，将供体生物的基因组DNA切割成许多片段 将所有片段连接到载体上，构成一个重组DNA群体 这个群体包含全基因组的遗传信息 cDNA文库 cDNA library 以mRNA为模板，经反转录酶合成互补DNA(complementary DNA，cDNA) 将双链cDNA与适当载体连接 转化到宿主细胞内进行扩增，建成cDNA文库 2、PCR技术扩增——聚合酶链式反应 前提： 条件： 一段已知目的基因的核苷酸序列 原料、模板、引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶）温度控制 变性 复性 延伸 1.目的基因DNA受热变性，解链； 2.引物与单链互补结合； 3.合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。 3、化学方法合成目的基因 双链DNA (即目的基因) 反转录 合成 单链DNA (cDNA） 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 目的基因 推测 推测 化学合成 目的基因的mRNA 优点 缺点 基因文库 反转录法 根据已知氨基酸合成DNA法 操作简便广泛使用 工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因 专一性强 操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高 专一性最强 仅限于合成核苷酸对较少的简单基因 —— 核心 二、形成重组DNA分子 质粒 DNA分子 一个切口 两个黏性末端 两个切口 获得目的基因 DNA 连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 同一种 限制酶 目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。 基因表达载体的组成： 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 a、目的基因 b、启动子 c、终止子 d、标记基因 工具——运载体/载体 任务3 写出常用的运载体、作为运载体的条件和作用 2、作用： 将外源基因转移到受体细胞中去。 在受体细胞的复制内，对外源基因(目的基因)进行大量复制。 1、常用载体：质粒、噬菌体或某些动植物病毒 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌染色体（即拟核DNA）之外，且具有自我复制能力的双链环状DNA分子。有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。 作为运载体必须具备的条件 1）能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。 2）具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 3）具有某些标记基因，便于进行筛选。 4）必需是安全的，不会对受体细胞有害。 5）大小应适合，便于提取和操作 （2）?噬菌体载体 1、?噬菌体； 2、?噬菌体DNA； 3、?噬菌体DNA中间 基因簇； 4、将连接物体外包装后感染细菌，制备基因库（用于基因库构建） 工具——DNA连接酶 将双链DNA片段（扶手的断口）“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷之间的磷酸二酯键。 比较各种不同的酶 任务4 名 称 作 用 参与生理过程及应用 作用 位点 DNA连接酶 限制性酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 解旋酶 逆转录酶 作用位点示意图 名 称 作 用 参与生理过程及应用 作用 位点 DNA连接酶 连接两个DNA片段 基因工程 a 限制性酶 切割特定的脱氧核苷酸序列 a DNA聚合酶 在脱氧核苷酸链上添加单个脱氧核苷酸 DNA复制 a RNA聚合酶 在核苷酸链上添加单个核苷酸 转录 解旋酶 使碱基间氢键断裂形成单脱氧核苷酸链 DNA复制及转录 b 逆转录酶 以RNA为模板合成DNA 逆转录、基因工程 生物种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 受