姜黄素对黑色素瘤B16-F10细胞增殖及线粒体凋亡影响机制研究.docVIP

姜黄素对黑色素瘤B16-F10细胞增殖及线粒体凋亡影响机制研究 　　摘 要 目的：探讨姜黄素体外抗黑色素瘤的药效及作用机制，为姜黄素抗肿瘤的药理机制提供实验依据。方法：以黑色素瘤B16-F10细胞为实验材料，在离体水平研究姜黄素对细胞活力、细胞内活性氧水平、细胞凋亡的影响［1］。结果：姜黄素能显著抑制B16-F10细胞增殖、促进其凋亡；姜黄素可促进B16-F10细胞活性氧水平增高，且显著提高细胞内Caspase-4,9蛋白的表达，可能通过启动线粒体凋亡途径发挥促癌细胞凋亡生物活性。结论：姜黄素对黑色素瘤具有显著抑制作用［2］，其可能的机制是通过提高细胞内活性氧水平，启动线粒体凋亡途径而发挥促黑色素瘤细胞凋亡的作用。 　　关键词 姜黄素 黑色素瘤 B16-F10细胞株 线粒体凋亡 　　黑色素瘤是由异常黑素细胞过度增生引发的常见的皮肤肿瘤，其特点是恶性程度高、进展快、死亡率高［3］。临床恶性黑色素瘤的治疗常采用手术结合联合化疗方案［4］。本研究以黑色素瘤细胞株B16-F10为实验材料，观察姜黄素体外抑瘤作用。同时，以活性氧激活线粒体凋亡途径为切入点，探讨姜黄素抗黑色素瘤的可能分子机制［5］，进而推断姜黄素的分子药理学作用。 　　材料与方法 　　材料：姜黄素(纯度≥98%)；RPMI1640、胎牛血清、HEPES、EGTA、BSA、DMSO等；MTT；DCFH-DA活性氧探针；线粒体提取试剂盒；Caspase-9(p-35，sc-8355)兔抗小鼠多克隆抗体；Caspase-4(ab-25898)兔抗小鼠多克隆抗体；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒；常规生化试剂；B16-F10小鼠皮肤黑色素瘤细胞株。 　　方法：①细胞培养：B16-F10细胞常规培养，每3天传代一次，实验时取对数生长期细胞，用0.25%Trypsin-EDTA液消化后，用培养基制成细胞悬液。②细胞生长活力测定：细胞于96孔板培养24、36、72小时；向待检测的细胞培养板中加入MTT溶液(每孔20μl)，于CO2培养箱中孵育4小时；吸出培养板中的液体，加入100μl DMSO溶液，置于振荡器混匀10分钟，酶标仪在450nm波长下测OD值；采集数据，依照下列公式计算细胞生长抑制率：(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。③DCFH-DA活性氧检测：实验方法依照试剂盒说明进行，采用激光共聚焦显微镜观察，530nm发射波长附近激发为绿色。④细胞涂??TUNEL染色、荧光显微镜观察：细胞接种于6孔板(3ml/孔)，细胞接种密度4×105 cells/ml，被试药物干预24、48小时后收集细胞、预冷的0.1M PBS洗3次，用细胞离心涂片机将细胞甩到多聚赖氨酸包被的载玻片上；4%多聚甲醛固定30分钟、风干；1% Triton X-100 PBS透膜；加入TdT酶、荧光标记液及TUNEL检测液、孵育60分钟；抗荧光淬灭液封片、荧光显微镜观察、摄片。⑤细胞涂片Caspase-4，9抗体免疫组织化学显色、光镜观察：细胞接种于6孔板(3ml/孔)，细胞接种密度4×105 cells/ml，被试药物干预24、48小时后收集细胞、预冷的0.1M PBS洗3次，用细胞离心涂片机将细胞甩到多聚赖氨酸包被的载玻片上；4%多聚甲醛固定、风干；1%Triton X-100 PBS透膜；正常动物血清封闭抗原；加一定稀释度的Caspase-4，9一抗(50μl/片)，4℃湿盒孵育、过夜；加入通用型2抗PV-6001；AEC显色(红色)、光镜观察、摄片。 　　统计学处理：定量数据采用SPSS11.0软件包进行统计学分析，结果以X±S表示，组间比较采用单因素方差分析，t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。 　　结 果 　　姜黄素对B16-F10细胞生长抑制率的影响：用12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml四个浓度姜黄素孵育B16-F10细胞24、48和72小时，倒置显微镜下可观察到随着药物作用时间的增加B16-F10细胞形态学的变化：细胞变圆、体积缩小、悬浮细胞(脱落)显著增多。MTT法检测，数据换算、统计分析结果表明姜黄素对B16-F10细胞的生长抑制存在时间和剂量的依赖性。 　　姜黄素对B16-F10细胞氧化损伤：依照前期实验的结果，本实验选择50μg/ml的给药剂量作用体外培养的B16-F10细胞。分别在孵育24、48小时采集细胞，采用DCFH-DA活性氧检测试剂盒，在激光共聚焦显微镜下观察姜黄素对B16-F10细胞活性氧水平的影响。结果表明姜黄素孵育48小时，能显著增高B16-F10细胞内活性氧水平，引起细胞形态改变。与对照组比较，姜黄素孵育48小时，B16-F10细胞内活性氧自由基水平显著增高(P＜0.01)。 　　姜黄素对B16-F10细胞凋亡的影响：一步