sirna的发展历史原理应用的最新进展和发展趋势.pptxVIP

siRNA制备方法In vitroＡ、化学合成Ｂ、体外转录Ｃ、酶切长链dsRNAIn vivoＤ、载体表达siRNAＥ、PCR合成siRNA表达元件A. 化学合成法方法简单、快速，需要时间短；获得的siRNA纯度高适用于短期体外实验研究，尤其适用于需要单一siRNA序列的研究siRNA可进行标记需要进行大规模的筛选来确定单一的siRNA序列不适用于长期研究不适用于siRNA序列的筛选siRNA序列设计注意事项选择以AA开头的19-21nt长的序列靶定序列从起始密码子下游75-100个nt处开始，到终止密码子上游75-100nt处结束选择 2-4个靶定序列，以筛选特异性最好的进行实验 选择的序列中 GC含量在 30-70%,最好在50%左右,在一排序列中避免出现3 个以上G。 若需要发卡结构，发卡部分长度一般为6-9nt，有文献报道9nt效果较好.最后,选择的DNA 片段经/BLASTBLAST 查询,应与其它人类基因无同源性 设定适当的对照 设置适当的siRNA对照1) 与靶定siRNA有相同的碱基组成，但排列完全不同，且不与其它基因由同源性 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG SN(G4,C5,A5,T6) ATTCGTGCTCAATGCAATCG NSN(G4,C5,A5,T6)2)1-2碱基错配的 siRNA对照 (1-2nt) AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG AGCCTTAGTTTAAATCCTAG T 和 A错配siRNA序列设计根据文献报道，使用确定的siRNA序列许多网站提供siRNA设计软件，只需输入靶定基因序列，即可提供候选siRNA序列；比如/Ambion/公司,/武汉晶赛B、体外转录合成短的siRNAT7 RNA 聚和酶体外转录DNA，直接产生小片断的siRNA，快速、灵活，适用于siRNA序列的筛选以及化学合成siRNA价格昂贵时siRNA可进行标记可重复性差，不适用于长期研究和需要大量单一siRNA序列的研究 C、 使用Dicer酶切长片断dsRNA产生siRNA使用T7RNA聚和酶体外转录,产生长片断的dsRNA，然后使用Dicer酶消化，产生短的siRNA产生的为siRNA的混合物，因此沉默效果较好该方法方便、简单、需要时间短，容易操作适用于快速而便宜的表型功能缺失研究可对产生的siRNA进行标记不适用于长期研究和需要确定的单一siRNA的研究可能产生非特异性的基因沉默１、含有T７启动子的PCR产物的合成２、长的dsRNA的转录合成３、 siRNA的消化，和纯化D1、质粒载体合成siRNA（非病毒）首先合成具有发卡结构的DNA，构建到含有U6 或者H1 启动子的质粒中，质粒转入细胞，在启动子操纵下转录生成siRNA;该方法可在胞内持续产生siRNA，适用于长期研究;价格较贵，构建过程相对复杂，只适用于体外研究D2、病毒载体合成siRNAsiRNA在病毒骨架上进行转录，适用于原代细胞、可进行体内和体外实验；有可能进行稳定转染使用腺病毒载体：可进行体内实验，转染效率高使用逆转录病毒载体：可进行整合，导致稳定转染 构建过程复杂，成功率相对较低，而且具有安全隐患E、PCR方法构建siRNA表达元件（SEC)PCR方法构建含有特定启动子和终止子以及靶定DNA序列的表达元件转染到胞内后，在启动子操纵下，siRNA表达方法简单，无需构建载体；适用于siRNA序列筛选，及载体克隆前启动子的筛选不适用于长期研究常用的发卡结构中Loop环的长度和序列?化学合成体外转录核糖核酸酶消化dsRNASiRNA表达载体PCR表达元件需要条件21-mer RNA片断29-mer DNA 片断转录模板 (200-800 bp侧翼含有T7 启动子)55-60-mer DNA 片断~50-mer DNA 片断需要的时间4天-2周24 小时加上DNA 准备时间 1天加上转录模板准备时间5天加上DNA 准备时间~ 6小时加上DNA准备时间工作量少或无中等中等高中等是否需要检测优化 siRNA 序列需要需要需要不需要需要可否进行标记（以分析转染效率和显微镜定位可以可以可以不可以不可以转染的容易程度好好好很容易很容易可否筛选（即抗生素筛选）不可以不可以不可以可以不可以可否用于长期研究不不不带有选择性标志则可以不能否大规模合成可以受限受限可以受限能否检测群体的转染效率不不不可以不每个基因需要的费用（不包括劳力）高中等抵中等中等　ＲＮＡ干扰的应用（Application）基因功能的研究（Gene function）基因治疗（Gene therapy） ---遗传性疾病（Hereditary disease） ---病毒感染引起的疾病（Diseases by virus）：如艾滋病，肝炎等 ---肿瘤（Tumor）新药开