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PCR法检测HBV 实验原理 PCR技术的基本原理　 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 琼脂糖凝胶电泳原理 琼脂糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术，可用于分离、鉴定和纯化DNA片段。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭（EB)结合，在紫外灯下可看到荧光条带，借此可分析实验结果。 实验材料 1. 模板：重组质粒（将乙肝病毒特定段基因导入到质粒中） 2. 特异性引物 上游引物：5’-CACCTCCTCCTGCCTCCACCAATC- 3’(1299-1322)24 bp 下游引物：5’-GGCCCCCAATACCACATCATCCAT- 3’(2133-2157)24bp 3. DdH2O,缓冲液10×buffer+Mg2+，dNTP,Taq 4. 溴酚兰 ：BIOER，Lot NOstorage -20℃ 5. Marker：BIOER，BioDL2000，Lot NO实验仪器 1. 电泳仪，生产厂家：北京百晶生物技术有限公司，型号BG-Power600 2. 基因扩增仪，生产厂家：EPPENDOF 3. UVP Bioimaging systems，American UVP corporation，GDS-8000 system 4. 微型漩涡混合器，上海康华仪器制造有限公 司，型号WH861 5. 微量加样器，生产厂家：北京百晶生物技术有限公司 6. EP管 ②从管中分别吸取23μl混合液加入到另外5 个EP管中，然后分别向其中4个管中加入阴性对照、阳性对照、实验组1、实验组2四种模板2μl，另一管中加入2μlH2O做空白对照。 ③将以上五管放入离心机中离心，封口，放入基因扩增仪中扩增，反应条件如下： 94℃预变性5min 94℃变性45s 62℃复性45s 72℃延伸45s 72℃延伸10min 第二、三、四项设置为20个循环 琼脂糖凝胶电泳 ①将琼脂溶化后浇到电泳板上，待其凝固。 ②琼脂凝固后将胶板放入电泳槽中，注意有加样孔的一端放在阴极，然后向电泳槽中倒入缓冲液直至没过琼脂胶板。 ③从各管中分别取出6μl混合液与1μl溴化乙锭混合均匀，加入到点样孔内，注意不能把胶插破，也不能让液体溢出到孔外。 ④盖上电泳槽盖，接通电源，开始电泳。 UVP成像 电泳完毕后，将胶板放到UVP凝胶成像系统中成像，观察并对照结果 。 实验结果及讨论 实验结果 从左到右各区带依次为阴性对照、阳性对照、实验组1、实验组2、空白对照和Marker。 （1）除Marker外，其余各带均比较模糊。 （2）非特异性区带比较明显。 （3）假阴性，不出现扩增条带。 （4）假阳性 。