基因工程-第四章 目的基因的分离与修饰PPT.ppt

转座子载体构建 ↓转化植物（T1，杂合子)收获T2种子 ↓筛选T2，获突变体 ↓提取其DNA,建立基因组文库 ↓以转座子为探针，筛选突变体文库 ↓ PCR技术克隆转座子两侧的DNA序列 ↓利用侧翼DNA序列作探针从野生型植物的基因组文库中钓取基因 ↓基因功能的验证 转座子标签法克隆基因 3.2.5 酵母双杂合系统 ---利用生物大分子之间的互作分离基因 转录激活因子参与真核生物的基因转录。 AD BD 许多真核生物的转录激活因子都是由两个结构上可以分开的、功能上相互独立的结构域组成. 酵母双杂交法原理: 利用酿酒酵母的GAL4蛋白质N-端和C-端分别融合的两种蛋白质相互作用可激活具有UAS（upstream activating sequence，上游激活序列）报告基因表达筛选目的基因的方法。 i.?? GAL4蛋白质是一个调控基因，控制半乳糖利用酶类基因的表达，这些基因的5’-端存在UAS序列； ii.??GAL4存在两个结构域：N-端(1-147)具有UAS-DNA结合域(DNA-binding domain, BD), C-端(768-881)具有转录激活结构域(transcriptional activation domain, AD)。这两个结构域可以单独起作用。 AD BD iii.?如果AD和BD分别与两个基因编码序列融合，且两种蛋白质能相互发生结合，就可导致GAL1-LacZ基因的表达。其中与AD融合的基因称之为钓饵基因，与BD融合的基因可称之为目的基因(即建立的基因文库)。 酵母双杂交技术的基本原理 1）已知蛋白之间相互作用的检测： 2）蛋白质的功能域研究：通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检测是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨基酸； 3）克隆新基因和新蛋白：将感兴趣的蛋白质基因与AD基因构建成“诱饵”表达质粒，将某一器官或组织的cDNA文库与BD基因构建成“猎物”基因库， 共转化酵母细胞，可筛到与感兴趣蛋白质相互作用的蛋白质的cDNA序列，并推测其蛋白质序列。 用途 3.2.6染色体步差法分离目的基因 ---基因定位克隆技术 利用已知基因或DNA分子标记来分离与其紧密连锁的目的基因。 已知基因或分子标记做探针 目的基因的制备和分离 2.1 直接分离法 2.2 基因文库技术分离目的基因 2.3 基因组文库分离法 2.4 cDNA基因文库分离 2.5 PCR技术扩增目的基因 2.6 化学合成基因 思考题 图示说明考斯质粒基因组文库的构建，指出与λ噬菌体载体的区别。有何优缺点？ c DNA基因文库有何优点？如何构建？ 怎么样样估算基因组文库大小？结合图示简要说明λ噬菌体基因组文库的构建过程。 什么叫差别杂交？简述其原理？ 本章重点和思考题 目的基因的概念 基因文库的概念 基因组文库的概念及操作步骤。 cDNA文库的概念及操作步骤 基因组DNA文库与cDNA文库的优缺点？ 什么叫差别杂交？简述其原理？ 例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接。 在连接前将DNA片段进行分级分离 2.0 kb 1.6 kb 1.8 kb 冻融法 滤纸法 吸附法 低融点凝胶法 溶解法 凝胶DNA片段回收技术 鸟枪法操作的改进 鸟枪法克隆目的基因的局限性 工作量较大，需要了解目的基因的背景知识 不能获得的最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构。 原理： 将编码蛋白X、Y的DNA序列分别与这两个区域构建成融合蛋白BD-X和AD-Y两个杂交体 共转化酵母细胞（此酵母细胞下游有DNA结合位点的报告基因）， 若X和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录； 若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因的转录。 因此可通过检测报告基因的转录来研究蛋白质X和Y的相互作用。 3.4.3 抑制性减法杂交技术 Suppression subtractive hybridization, SSH 基本原理：结合cDNA单链标准化步聚和消减杂交步聚。 3.4.4 基因组错配筛选 Genomic mismatch scanning, GMS 基本原理：通过比较不同表型的基因组而直接分离基因。 获得两个基因组之间系统区域，IBD identical-by-descent 3.5 功能结合法筛选目的基因 基本