基因操作原理PPT.ppt

平台效应 plateau effect 在PCR反应后期,产物的积累按减弱的指数速率增长(一般已积累到0.3～1pmol产物) 原因: 底物浓度降低， dNTP or Primers dNTP or enzyme的稳定性 末端产物抑制(pyrophosphate焦磷酸, dsDNA) 非特异性竞争(非特异性产物or primer-dimer) 特异性产自身复性(10-8M) 高浓度产物下,变性不彻底. 避免出现背景 5．反应液的配制 (1) 常规 最后加酶,及矿物油 (2) 具3’-5’活性酶 A:template, primer, dNTP H2O B:buf enzyme H2O (3) 热起始 下层:dNTP buf primer 中间:蜡珠(Ampli Wax PCR Qam100) 上层: template (Taq) ·先加下层液,再一粒蜡株,70℃ 10min 5℃ 5min ·迅速加30?l上层混合物 四、PCR介导的克隆 (一)添加限制性酶切位点 1.引物的设计 (引入酶切位点） 切点的类型 优先8 base序列, 如AscI NotI PacI, PmeI, SfiI, SrfI 若内部序列为已知, 则可根据需要进行设计 切点的位置