《实时荧光pcr》ppt课件.pptx

PCR _UU、NG、CT测定 LOREM IPSUM DOLOR PCR技术基本原理 一、定义 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。 二、PCR反应的基本过程 ①变性（denaturation） 将模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA经加热至94℃左右一定时间后，双链之间的氢键断裂，双股螺旋解链，变成两条单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。 二、PCR反应的基本过程 ②退火(annealing) 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 二、PCR反应的基本过程 ③延伸（extension） DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按A-T、C-G碱基配对与半保留复制原则，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。重复变性--退火--延伸的循环过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 PCR反应体系的基本成分 模板DNA 特异性引物 DNA聚合酶 dNTP Mg2+的缓冲液。 PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Yn＝X*(1＋E)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，E表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，但随着PCR产物的逐渐积累，其对扩增过程出现负作用，再加上酶的消耗疲劳，整个扩增将进入线性增长期或平台期，此时，扩增产物不再呈指数增加，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期。 实时荧光定量 PCR 原理： 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图 ( 如图 ) 。 CT 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， CT 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表 Ct 值（如图 所示）。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。 探针荧光技术原理 将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。 实验步骤 解脲支原体DNA测定实验步骤 试剂配制 样本数（样本数＝待测标本数+质控品5个+1）n配制反应液 UUPCR缓冲液n×18ul、Mgcl2n×3ul、UU荧光探针n×3ul、Tap酶n×2ul配制，按26ul分装。 解脲支原体DNA测定实验步骤 标本漂洗液200ul→13000rpm离心10分钟→吸弃上清→加入50ulDNA裂解液→震荡混匀、温浴10分钟→13000rpm离心2分钟→上样→低速离心数秒→全自动荧光PCR仪 扩增程序：50℃-----1分钟 94℃-----2分钟