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实验八ABO 血型的基因型检测 一、实验目的与原理 1.目的 了解ABO血型的遗传学原理 掌握在DNA水平上鉴定ABO基因型的基本原理和操作过程 2.原理 ABO 血型抗原是由 I A ; IB ; i 基因编码的特异性糖基转移酶催化合成的红细胞膜表面的糖蛋白和糖脂。 ABO 基因座位位于第九号染色体上,其3 个等位基因I A 、 IB、 i 形成4 种主要的血型A、B、AB 和O。 ABO血型系统遗传方式 A血型： IA I A ; IAi B血型： I BIB ; IBi AB血型：IAIB O血型： ii IA基因与IB基因之间在cDNA上有7个单碱基替换：A294G、C523G、C654T、G700A、C793A、G800C和G927A。 i基因与IA基因相比只是cDNA的第258位的胞嘧啶缺失，出现框移突变，使第352位的1-rA变成了TAA(终止密码子)，提前终止了转移酶的合成，导致合成的转移酶没有活性区，所以在红细胞膜上没有Ａ，Ｂ 抗原的产生。 根据genebank上公布的I A 、 IB 、 i 基因序列设计引物，扩增ABO糖基转移酶基因中的2个区段。 引物由上海生工合成，引物序列为： 引物1：5′-CACCGTGGAAGGATGTCCTC-3′ 引物2：5′-AATGTCCACAGTCACTCGCC-3′ 引物3：5′-GTGGAGATCCTGACTCCGCTG-3′ 引物4：5′-CACCGACCCCCCGAAGAA-3′ 用1、2引物进行PCR扩增，等位基因IA ， IB产物为200bp，等位基因i (258位G缺失) 产物为199bp。 限制性内切酶kpn I ： i基因PCR产物 199bp 切出171bp＋28bp， IA ， IB基因PCR产物 200bp没有该酶的切点依然是200bp。 用3、4引物进行PCR扩增，等位基因I A 、 IB 、 i的产物均为159bp。 限制性内切酶Alu I ： IB 基因PCR产物 159bp 切出118bp＋41bp， I A 、 i基因PCR产物 159bp没有该酶的切点依然是159bp kpnI（1，2引物产物）消化： A，B基因 200bp：———————— 200 O基因 199bp: ————— —— 171 28 Alu I消化(3,4引物产物): A，O基因 159bp：———————— 159 B基因 159bp: ————— —— 118 41 二、实验用品 PCR扩增仪、 电泳仪和电泳槽、微型移液器、恒温水浴锅 、凝胶成像系统等，离心管、PCR管、移液器枪头等 蛋白酶K 、Triton X-100、TKM液 、10%SDS、DTT、饱和NaCl、95%冰乙醇、TE缓冲液、10×PCR buffer、Taq DNA Polymerase、10×Easy Taq DNA Polymerase Buffer 、dNTP 、KpnⅠ、10×Buffer KpnⅠ（with BSA）、AluⅠ、10×BufferAluⅠ（with BSA）、DNA Marker 三、实验内容与操作 1.材料准备： 收集志愿者带有毛囊的头发6~7根，用无水乙醇清洗、蒸馏水漂洗后，自然风干待用。 每根头发取毛根0.5cm，剪为两段，分别放入至0.2mL 离心管中（每管中的头发均取自同一个体）。 2. DNA提取：DTT- TKM-TritonX-100抽提法 每管样品加入200μL TKM液，混匀，加1滴TritonX-100，混匀， 6000r/min离心5min ，弃上清。 将沉淀溶于40μL TKM液，加3μL 10%SDS，4μL蛋白酶K （0.2 g/L），8μL DTT（4 mol/L），剧烈混匀，55 ℃水浴5min。 加入15μL饱和NaCl（6 mol/L），混匀，13000r/min离心5min。 转移上清约40μL至另一管中，加2.5倍体积95%冰乙醇，- 20℃，30min。 13000r/min离心10min，弃上清，加75%冰乙醇洗1 次，干燥，溶于100μL TE，-20℃保存。 扩增程序： 1. 94℃预变性5min 2. 94℃变性50s， 3. 60℃退火30s， 4. 72℃延伸60s， 5. 72