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双向电泳完整操作流程 仪器： Eppendorf 冷冻离心机 (Eppendorf) 、Beckman Coulter 高速冷冻离心机 （Beckman Coulter ）、IPGhor 等电聚焦仪（GE Healthcare ）、DALT-SIX SDS电泳仪（GE Healthcare ）、ImageScanner 扫描仪（GE Healthcare ）、 ImageMaster 2D Platinum 7.0 分析软件（GE Healthcare ）、电子天平、分光光度 计、旋涡混和器、PH 计、真空冷冻干燥机、液氮、离心管、研钵 - 1 - 主要溶液配置： 三氯乙酸-丙酮沉淀液：10%三氯乙酸、0.07%巯基乙醇溶于 100%丙酮 丙酮洗涤液：0.07%巯基乙醇溶于丙酮 样品裂解液：9mol/L 尿素、4 ％CHAPS、1%IPG buffer （GE Healthcare ）、 1%DTT 样品水化液：9mol/L 尿素、4 ％CHAPS、1%IPG buffer （GE Healthcare ）、 1%DTT、少量溴芬兰 定量染色液：0.01% （w/v ）G250，8.5%磷酸和 4.75% 乙醇 标准蛋白溶液：1mg/ml 牛血清蛋白 平衡缓冲液 1：6mol/L 尿素、50mmol/L Tris-HCL(pH=8.8) 、30%甘油、 2%SDS ，1%DTT，痕量溴酚兰 平衡缓冲液 2 ：6mol/L 尿素、50mmol/L Tris-HCL(pH=8.8) 、30%甘油、 2%SDS ，4%碘乙酰胺，痕量溴酚兰 12%SDS凝胶溶液：12%丙烯酰胺、0.32%双丙烯酰胺、0.375mol/L Tris-HCL （pH=8.8 ）、0.1%SDS、0.05%过硫酸铵、0.05%TEMED 电泳缓冲液：25mmol/L Tris 、192mmol/L 甘氨酸、0.1%SDS 封胶液：25mmol/L Tris、192mmol/L 甘氨酸、0.1%SDS、0.5%琼脂糖 考染固定液：12% （W/V ）三氯醋酸 考染染色液：0.12%G-250、10% （NH ） SO 、10% H PO 、20% 甲醇。 4 2 4 3 4 考染漂洗液 1：0.1mol/L Tris-H PO (PH6.5) 3 4 考染漂洗液 2 ：25% 甲醇 考染稳定液：20% 的（NH ） SO 溶液 4 2 4 银染固定液：40% 甲醇、10%乙酸 银染敏化液：30% 甲醇、0.2%硫代硫酸钠、6.8%无水乙酸钠 银染染色液：0.25%硝酸银 银染显影液：0.25%碳酸钠、0.04% 甲醛溶液（37%，w/v ） 银染停显液：1.46%EDTA.Na .2H O 2 2 - 2 - 蛋白提取： 一、细胞 7 1、取大约 5*10 个细胞用 PBS 溶液悬浮清洗，1000g 离心 10min 取沉淀并 重复以上步骤两次，收集沉淀于 1.5ml 离心管中， 2 、加入样品裂解液，低温超声处理 5min 后转入 36℃水浴裂解 1h， 3、室温 15 000g 离心 15min，收集上清并再次离心，上清即为提取的细胞 总蛋白溶液， 4 、采用Bradford法[Marion M. Bradford. Analytical Biochemistry, 1976, 72: 248-254]测定提取的蛋白浓度， 5、样品分装后储存于-80℃备用或