第3章 抗体制备PPT.ppt

第三章 抗体制备; 教 学 目 的;第一节 免疫原的制备;一、颗粒性抗原; ;二、可溶性抗原;组织和细胞成分混合抗原制备程序;2.细胞可溶性抗原的破碎;（1）超声破碎法;（2）酶处理法;（3）反复冻融法;（4）表面活性剂处理法;（二）可溶性抗原的提取和纯化;2.选择性沉淀法： 核酸去除法－氯化锰、鱼精蛋白 盐析法－硫酸铵、硫酸钠 有机溶剂沉淀法－乙醇、丙酮 聚合物沉淀法－聚乙二醇 ;盐析沉淀法;; 3. 凝胶层析法;Sephadex G-200凝胶;4. 离子交换层析法;离子交换 纤维素;5.亲和层析法;★亲和层析支持物的选择： ①非特异性吸附低； ②液体流速快； ③在各种pH和高浓度盐溶液中稳定； ④有合适丰富的化学基团 ⑤有丰富的微，以增加结合容量。;★配体的选择条件： ①抗原或抗体必须单一特异性； ②抗原与抗体具有较高的亲和力； ③配体必须有一个适当的化学基团。;★抗原或抗体与支持物的结合： ①活化：溴化氰； ②接“手臂”：带“手臂”琼脂糖有氨基琼脂糖、羧基琼脂糖、溴乙酰琼脂糖、重氮盐衍生物琼脂糖、疏基琼脂糖。;★亲和层析条件的选择： ①封闭活性基团 ②除去未结合和结合不牢的蛋白 解脱剂： 3mol/L 硫氰酸钾（或钠）、 0.1mol/L pH2.4甘氨酸缓冲液;★（三）免疫球蛋白片段的制备： 1. 解离二硫键 2. 溴化氰裂解法 3. 酶裂解法 ;三、半抗原;1、载体的选择;;碳化二亚胺法：;戊二醛法:;第二节 免疫佐剂;一、佐剂的种类;弗氏佐剂(Freund,s adjuvant)： 弗氏完全佐剂－羊毛脂 与液体石蜡的混合物 弗氏完全佐剂－弗氏不 完全佐剂加卡介苗;作用大于不完全佐剂 局部形成肉芽和溃疡 不能用于人体 ;细胞因子佐剂 IL-1、IL-2、INF?、GM-CSF 应用: 抗寄生虫免疫 抗肿瘤免疫 ;二、佐剂的生物学作用; 三、佐剂的作用机制 1.改变抗原的物理性状、延缓抗原降解、延长停留时间、有助于APC对抗原的摄取。 2.活化APC，增强APC对抗原的加工和提呈 3.刺激淋巴细胞增殖分化，扩大免疫应答;第三节 多克隆抗体的制备及应用; 抗血清的制备是将制备好的免疫原按照一定的免疫程序接种给所选择的动物，???动物在含有多种抗原表位的抗原刺激下，体内多个B细胞克隆被激活并产生针对某一抗原多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体 ;多克隆抗体 天然抗原刺激多种B淋巴细胞克隆产生的多种抗体的混合物 。;一、免疫动物的选择;二、抗原剂量的选择;三、免疫程序;四、采血方法;五、抗血清的鉴定和保存; 抗原的制备 抗原的分离纯化 纯化抗原的鉴定 佐剂 免疫动物 制备抗血清 抗血清的鉴定、保存;五、抗血清的鉴定及保存;1.抗体效价和纯度的测定;;1.抗体效价和纯度的测定 可用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法鉴定纯度，如出现多条电泳带，即提示抗血清中杂蛋白较多，需近一步纯化。 ;;3. 抗体亲和力的鉴定;4. 抗血清的保存;六、 抗体的纯化;（一）IgG类抗体的纯化;1.盐析法 （1）硫酸铵盐析法： （2）硫酸钠法（ 20% ）;2. 离子交换层析法 常用的离子交换剂有DEAE纤维素或QAE纤维素。此法获得的IgG较纯，不含其它杂蛋白。;3. 亲和层析法装柱上样结合洗脱;（二）特异性抗体的纯化;１.亲和层析法;单价特异性抗体;２、吸附法;第四节 单克隆抗体的制备及应用 ;;;三、单克隆抗体的生产;四、单克隆抗体纯化;六、单克隆抗体的特性;七、单克隆抗体的应用;第五节 基因工程抗体及应用;思 考 题;小 结;本章概要