第七单元 超敏反应性疾病的免疫学检测PPT.ppt

第七单元 超敏反应性疾病的免疫学检测;实验一 血清IgE的检测;一、血清总IgE的检测;; 实验材料 1.羊抗人IgE抗体、HRP标记的羊抗人IgE抗体、IgE校准品、TMB（四甲基联苯胺）。 2.标本：待测血清。 3.包被缓冲液、洗涤缓冲液、反应终止液（2 mol/L H2SO4）等。 4.酶标板、微量加样器、酶标仪、温箱等。;8.加入终止液，终止反应 ; 注意事项 1.包被抗体量、酶标抗体的加入量等可影响测定结果，需预先摸索最佳条件。 2.洗涤要彻底，必要时可加大洗涤液的浓度。 3.结果判断须在10分钟内完成。 4.IgE含量与吸光度值在一定范围内呈线性关系，如果样品的测定结果超出此范围，应对样品进行适当的稀释，使样品中IgE的浓度在线性范围内再行测定。; 结果分析 以IgE校准品的参考含量（IU/ml）为横坐标，以对应A值为纵坐标，绘制标准曲线。根据待测样品的A值，在标准曲线中查出稀释后样品中IgE的浓度，再乘以稀释倍数，即为原样品中IgE的浓度。1IU=2.4ng。; 临床意义 血清总IgE水平一般用国际单位（IU）或ng表示，1IU＝2.4ng，相当于WHO标准冻干血清制剂0.00928mg内所含的IgE量。正常人群IgE水平受环境、种族、遗传、年龄、检测方法及取样标准等因素的影响，以致各家报道的正常值相差甚远。婴儿脐带血IgE水平小于0.5IU/ml，出生后随年龄增长而逐渐升高，12岁时达成人水平。成人血清IgE水平约在20～200IU/ml之间，一般认为大于333IU/ml（800ng/ml）时为异常升高。 IgE升高相关的常见疾病有：过敏性哮喘、季节性过敏性鼻炎、特应性皮炎、药物性间质性肺炎、支气管肺曲菌病、麻风、类天疱疮及某些寄生虫感染等。上述疾病时IgE升高的程度并不一致，在过敏性支气管肺曲菌病时最为显著，其值可达5000～20000ng/ml，除了此病和特应性皮炎以及在花粉季节之外，任何血清总IgE水平大于5000ng/ml的患者均应考虑寄生虫感染的可能性。; 思考题 1. ELISA双抗体夹心法定量测定血清总IgE的原理及应注意的问题有哪些？ 2. 测定血清总IgE的临床意义？ ;二、血清特异性IgE的检测; 实验原理 ; 实验材料 1. 检测条 包被有特异性过敏原的NC膜 2. 碱性磷酸酶标记的抗人IgE 3. 标本稀释液 4. 碱性磷酸酶底物 5. 浓缩洗???（10X） 洗液按照1:10倍稀释 6. 标本 待测血清用标本稀释液按照1:10倍稀释。;稀释好的洗液将检测条要充分浸透，放在摇床上摇10分钟; 注意事项 1. 不同批次的组分不可混用，且只能在效期内使用。 2. 检测标本只限于人血清、血浆。 3. 如果样本在3天内检测，可以保存在2~8℃，否则应冷冻保存，避免反复冻溶。 4. 如果标本含有不溶物，离心去除。溶血、浑浊或含有叠氮钠的标本不可用。 5. 加样器枪头不可混用，避免交叉污染。;结果分析;小结和讨论; 思考题 1. 测定血清sIgE的方法有哪些？各有何优缺点？ 2. 测定血清sIgE的临床意义？ ;实验二 红细胞表面不完全抗体的检测;一、直接Coombs试验（试管法 ） ;＋; 实验材料 1.诊断试剂 抗球蛋白试剂； 2.待测患者红细胞； 3.生理盐水、小试管、吸管、离心机等。;操作步骤 用生理盐水配5%红细胞悬液 取洁净小试管2支，1管加1滴5%红细胞悬液，另一管加生理盐水作对照 在生理盐水和5%红细胞悬液中分别加入诊断试剂一滴，使其混匀，室温稍待片刻 1000r离心1 min或3000r离心15s。 取出试管先以肉眼观察有无溶血，再轻轻摇动试管，如有凝集，则为阳性结果；如无凝集，应在室温延长15~30 min的反应时间，再离心看结果。; 注意事项 1. 每次试验均须设阴、阳性对照，如阴性对照发生自凝，实验无效。 2. 受检血标本必须新鲜。 3. 洗涤后的红细胞和器材都不能残留有血浆蛋白，以免出现假阴性。 4. 操作过程中动作轻柔，特别是观察反应结果时，应轻轻摇动试管，不可用力过大。 5. 判定结果时，溶血与凝集有同样意义。 6. 试验后应将玻片即时放入消毒缸内。;结果分析 生理盐水对照不应发生凝集，为均匀浑浊的乳状液。在红细胞悬液中，如红细胞凝集成片状，边缘皱褶如花边状或边缘松散为阳性。如与对照相同，为阴性。; 临床意义 直接Coombs试验用于检测患者红细胞上不完全抗体，Coombs试验阳性可见于自身免疫性溶血性贫血、冷凝集素综合征、药物诱发的免疫性溶血性贫血、新生儿同种免疫性溶血病、某些高球蛋白血症患者，如系统性红斑狼疮、类风湿、恶性肿瘤等。;二、间接Coombs试验（微柱凝胶法