细胞原代培养之外周血淋巴细胞培养PPT.pptVIP

外周血淋巴细胞的培养 (Lymphocyte culture) 实验目的 学习悬浮细胞的培养方法 悬浮细胞的形态特征观察 实验原理 外周血淋巴细胞表面有丝分裂原受体，当在培养液中加入丝裂原PHA时，可与淋巴细胞表面的相应受体结合使其活化增殖。 实验材料 骨髓细胞:来自小鼠股骨 设备及主要用品 1、? 纯水制备设备 2、? 电热干燥箱 3、? 高压蒸汽消毒锅 4、? 离心机 5、? 超净台 6、? CO2培养箱 7、 过滤器及0.22?m滤膜 8、 血球计数板 9、培养瓶或培养皿　 实验步骤 （1） 配培养液：完全培养液组成 RPMI 1640基础培养液 90％ 小牛血清 10％ 肝素（180 IU／ml） 3.6 IU/ml PHA（2 mg/ ml） 40 ?g/ml 青、链霉素 100 IU/ml 100 ?g/ml 调pH至6.8－7.2，0.22 ?m滤膜过滤除菌。 (2)获取骨髓细胞 1)断颈处死小鼠，浸泡在75％乙醇中3－5min. 2)剪切后肢，去掉肌肉，剥出股骨放入2%柠檬酸钠溶液中，剪刀剪开两端，用注射器吸取溶液吹打将骨髓细胞冲出，直至骨髓腔呈白色，将骨髓细胞溶液1000rpm离心10min. 3)弃上清，将细胞重悬于2mlHanks液。 实验步骤（3）分离淋巴细胞 用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。 分离方法： 1、先在带盖离心管中加入2 ml淋巴细胞分离液，再沿管壁缓慢加入2ml骨髓细胞，注意不要破坏两液交界面的液面。 2、2000rpm离心20min，两液交界面的白色薄层即为淋巴细胞。吸出转入另一离心管。 实验步骤（4）洗剂淋巴细胞 D’Hanks液4 ml洗一次 1640完全培养液4 ml洗一次 每次1000rpm离心5 min，弃大部分上清，约留1ml计数。 实验步骤（5）细胞计数 用血细胞计数板计数。 一般计数四周大方格内细胞，密度计算公式为： 细胞密度（个/ml）＝(4大方格细胞总数/4)×10000×稀释倍数 * * 计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格（图Ⅷ-2）；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格（图Ⅷ-1，C）。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格