[临床医学]PCR技术在乙肝方面的应用.pptVIP

PCR技术在乙肝方面的应用The application of PCR technique in HBV 涿州市医院检验科 刘鹏年 Hepatitis B Virus 乙型肝炎的病原体 在全世界广泛流行，估计全球半数以上人口已被HBV感染过。 中国：乙肝高发区，人群HBsAg的检出率达9.8% 乙型肝炎病毒感染的现状 全球约有3.5亿人感染乙型肝炎病毒，中国有1.2亿人感染，其中每年约有1-2%会出现肝硬化或肝癌而死亡。乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染病，它是由乙肝病毒(HBV)感染引起的。全世界乙肝携带者达5亿之多，我国是乙肝携带者高于人群的10％。急性乙肝中有20%会转为慢性，进而可能发展为肝硬化和肝癌，因此，准确、迅速诊断对乙肝的治疗和预后显得极为重要。 乙肝的实验室诊断 （一）生化学检查 （二）HBV血清学检查 （三）HBV DNA、基因型和变异检查 生化检测的局限性 敏感度有限 代表肝细胞损害，水平高低不能代表肝储备能力 关于“胆酶分离”现象 HBV血清学检查 项目：HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc以及抗-HBc IgM 方法 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，最常用，定性) 发光免疫分析(定量) HBsAg – 感染的标志 Anti-HBs – 既往感染/接种疫苗 Anti-HBc IgM – 急性感染标志 Anti-HBc IgG – 既往或慢性感染 HBeAg – 急性病毒复制，有传染性 Anti-HBe –病毒不再复制 HBV-DNA – 急性病毒复制，比HBeAg更准确；主要用于监测治疗反应 血清学检测的临床意义 HBsAg 抗-HBs HBeAg 抗-HBe 抗-HBc 临床意义 血清学检测的局限性 HBV具有“检测窗口期” 假阴性结果 无法检测突变株及抗体 PCR技术检测HBV DNA PCR 聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的K.Mullis建立，并和定点突变的发明者M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。 PCR反应过程 DNA的体外复制包括3个步骤： 变性（denaturation）:94 ?C 30s 退火（annealing）:55 ?C 30s 延伸（extension）:72 ?C 30-60s 3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。 普通PCR技术的缺点 普通PCR临床检测技术虽然解决了检出率低、周期长的问题，但由于假阳性率高，不能正确指导临床实践。 因此国家卫生部曾在1997年行文禁止将普通PCR技术用于临床诊断。 定量PCR的特点 采用闭管检测，不需PCR后处理，并采用dUTP-UNG酶的防污染系统，扩增和检测一次同时完成。不需开盖，不产生污染。 避免了假阳性。 探针与被检DNA序列特异杂交， 增强了特异性。 定量PCR的特点 HBV DNA检测方法的比较 为什么建议每个病人都要进行 HBV DNA检测？ HBV DNA检测的临床意义 HBV DNA检测的临床意义 HBV DNA检测的临床意义 HBV-DNA定量检测的临床应用 慢性乙肝诊断 治疗监测和疗效评价 跟踪随访 预后判断 HBV-DNA定量— 慢性乙肝的诊断 HBsAg阳性六个月以上 ALT持续升高或反复升高 HBV-DNA大于105拷贝/毫升（HBeAg阳性）或104拷贝/毫升（HBeAg阴性） HBV-DNA定量— 慢性乙肝的治疗监测 治疗前检测患者的基线水平（ALT、HBV-DNA） 治疗开始后前三个月每月一次、以后每三个月一次检测ALT、HBV-DNA，对于HBeAg阳性患者，还需检测HBeAg 如果治疗期间HBV-DNA水平降低两个数量级，可以认为治疗有效 HBV-DNA定量— 治疗后的随访 无论有否治疗应答，都应对患者定期随访。建议停药后的前3个月每月1次、以后每3～6个月1次检测ALT、AST、HBV血清标志物和HBV DNA，以及临床表现和不良反应。随访至少6-12个月。如病情有变化，可随时随访。 HBV拉米夫定耐药 虽然拉米夫定治疗慢性乙肝疗效显著，但长期使用拉米夫定会出现耐药现象 使用一年、二年、三年、四年的耐药比率为：15-32%、38%、56%、67% 一旦出现拉米夫定耐药突变（YMDD变异），大多数患者会在2-4个月之内出现HBV-DNA和ALT反弹 YMDD变异 YMDD变异检测 采用实时荧光定量PCR方法