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lncRNA 功能研究手册 随着生物技术检测手段的发展，我们发现人类基因组中90%的转录产物并不能翻译蛋 白。其中包含一类序列长度大于200 nt 的非编码RNA——lncRNA 。这些年来的研究表 明，lncRNA 以多种调控方式决定了生物体发育，疾病发生等过程。从目前发现的lncRNA 数目来说，已有5 万余条。但是，到目前为止，真正已知功能的lncRNA 不到1000 条。所 以，我们可以看到，lncRNA 研究领域，还是一个充满了潜力的大宝库。每一个研究领域， 研究方向都有发现新的lncRNA 功能的可能性。 1，lncRNA 的研究策略汇总 2 ．1 高通量筛选并确认ncRNA 为非编码RNA 经典的实验设计中，大多是通过高通量芯片或测序筛选差异表达的 lncRNA，并通过各 种生物信息学分析（GO、Pathway、cis-target 、trans-target 、co-expression、IPA、GSEA、 WGCNA 等）确认首选的lncRNA，并qRT-PCR 验证表达，Northern blot 去验证高通量筛选 的结果，并通过 / 或 / 或 CPAT ： /cpat/index.php 等预测编码能力。 2.2 3’RACE、5’RACE 实验确认其全长 目前，模式动物lncRNA 数据库中收录的lncRNA 的cDNA 序列相对比较准确，如果 想针对某条 lncRNA 开展表观遗传方面的启动子、转录因子等研究，或者准备做miRNA 与 lncRNA 的双荧光素酶实验，来验证某条miRNA 可以调控lncRNA，则需要获取5’UTR、3’UTR 的序列。 2.3 细胞定位可以帮助找到 lncRNA 作用方式的方向 找到 lncRNA 后，接下来的重要工作就是研究其调控方式。 从目前已有研究来说， lncRNA 的调控方式是多种多样的，染色质调控，转录调控，转录后调控，只要你想得到的， 都有它的身影。那么，当我们知道某一条 lncRNA 在细胞中特异性表达时，该怎么入手呢？ “脑袋跟着屁股走”， 在什么位置，担当着什么样的角色。我们可以通过传统的手段去确 认其细胞定位，来知道它主要在核内，还是在核外。如果是核内，那么，接下来考虑的作用 方式可以就是染色质调控， 转录调控（结合到启动子区，和某些转录因子互作，Pol II 的抑 制子……）；如果是核外， 那么，考虑的作用方式可能是转录后调控（影响 mRNA 的稳定 性，影响 mRNA 翻译，作为 miRNA 的”sponge”…… ）。 上图为最新引入的 RNAscope 技术发表的文章图片，下图为与客户合作发表的 lincRNA-uc002yug.2 原位杂交实验，比较明显的展示了 lncRNA 是定位于细胞核中，且只 在癌组织里面表达。 2.4 lncRNA 的过表达与干扰细胞建系研究具体功能 在经历上述常规实验之后 （生物信息学分析、qRT-PCR、Northern blot、编码能力预 测、 FISH 等xx生物均开始提供服务），下一步非常关键的就是建立 lncRNA 的过表达或干 扰细胞系来研究此 lncRNA 的功能，这对 lncRNA 最终能发多少分的文章有至关重要的影 响。 LncRNA 过表达细胞系 LncRNA 的过表达建系相对比较容易，通过数据库获得cDNA 序列之后，体外合成并构建慢 病毒、腺病毒或逆转录病毒载体，导入细胞后加药或荧光筛选即可获得稳转细胞系。 Zusen Fan et al., 2016 Nature structural ＆ molecular biology doi:10.1038/nsmb.3235 LncRNA 敲降细胞建系 lncRNA 的Fish 结果一般有三种情况 ：细胞质、细胞核、细胞核+细胞质，对于第一种lncRNA， 可以通过siRNA 即可实现敲降，但对于其他两种，由于siRNA 进入到细胞核中发挥作用的 概率比较低，比较大的影响了lncRNA 在敲降方面的功能研究。因此，科学家开始寻求siRNA 以外的技术应用与 lncRNA 敲降方面。随着 CRISPR/Cas9 的技术应用崛起，终于让