_免疫球蛋白标记技术应用课件.ppt

二、ELISA试验条件的选择 免疫吸附条件 酶标记的抗体（或抗原） 酶的底物 洗涤液 酶反应终止液 阳性对照品和阴性对照品 (一）免疫吸附条件 固相载体 包被的方式 包被用抗原 包被用抗体 包被的条件 封闭 标记抗体的应用 荧光抗体标记技术 酶标抗体技术 荧光抗体染色技术 荧光抗体标记技术（fluorescent-labeled antibody technique）是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。 荧光抗体技术的原理与方法 直接法操作简便，特异性高，非特异荧光染色因素少；缺点是敏感度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体。 间接法灵敏度高，且在不同抗原的检测中只需用一种荧光抗体。 补体法敏感度高，且只需一种抗体。但易出现非特异性染色，加之补体不稳定，每次需采新鲜豚鼠血清，操作复杂。因此较少应用。 双标记法用两种荧光素分别标记不同抗体，对同一标本作荧光染色。在有两种相应抗原存在时，可同时见到两种荧光色泽。 直接法 间接法 补体法 双标记法 基本过程 标本制备 固 定 洗 涤 染 色 观 察 （二）固定 防止标本脱落 除去妨碍抗原和抗体结合的类脂 固定的标本片易保存 目的： 常用抗原物质的固定方法 病毒 丙酮或无水乙醇 室温5-10 min 或 4 ℃ 30-60min 蛋白质 95%-100%乙醇 室温3-10 min 酶、激素 丙酮 4 ℃ 30min 抗原物质 固定剂 固定条件 多糖、细菌等 甲醇、10%甲醛或 室温5-10 min 或 丙酮（微火加热） 4 ℃ 30-60min （三）水洗 固定后以冷的PBS浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。 （四）染色 直接法 间接法 +AAbFITC 37℃ 30min PBS洗3次 PBS洗3次，蒸馏水冲洗 Ag+Ab 37℃ 30min PBS洗3次，蒸馏水冲洗 Ag+AbFITC （五）荧光显微镜观察 标本上滴加缓冲甘油（9份甘油，1份PBS），用盖玻片封片，荧光显微镜下观察。 间接荧光抗体检测细胞培养中的猪瘟病毒 （六）标本保存 固定标本片后低温保存，随用随染 染色片采用优质封固剂，防止荧光激发，封固后低温保存 酶标抗体技术 免疫酶组化 酶联免疫吸附试验（ELISA） （一）免疫酶组化 标本片固定 0.3%-3%H2O2 室温15-30min 缓冲液冲洗 酶标抗体37 ℃ 30-45min 缓冲液冲洗 DAB室温染色 缓冲液冲洗 干燥 脱水 二甲苯透明 封片 观察 直接法 间接法 对照组设置 已知阳性标本 已知阴性标本 抗体抑制试验 DAB-H2O2底物染色对照 检查内源性酶被抑制的情况 注意事项 标本必须新鲜，否则非特异性反应严重 消除内源性酶 消除背景颜色 酶标抗体浓度的确定 免疫组化常见问题 染色过强 非特异性背景染色 染色弱 染色阴性 1 染色过强 酶标抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长 孵育温度过高，孵育温度超过37℃ DAB显色时间过长或DAB浓度过高 2 非特异性背景染色  操作过程中冲洗不充分 组织中含过氧化物酶未阻断 组织中含内源性生物素 血清蛋白封闭不充分 3 染色弱 酶标抗体浓度过低，孵育时间过短 试剂超过有效使用期 操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释 室温太低，低于15℃ 4 染色阴性 操作步骤错误 组织中无抗原 一抗与二抗种属连接错误 酶联免疫吸附试验（ELISA） 原理：ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。加入酶反应的底物，由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果。 种类 间接法