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【TIANGEN讲堂】荧光定量PCR原理及方法应用2015-05-06?TIANGEN荧光定量PCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号对PCR进程进行实时检测。在定量PCR仪中包含有微量荧光检测系统，由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。常用的荧光激发方式有两种：卤钨灯和LED；荧光检测元件常用两种方式：光电倍增管和冷光CCD摄像机，并配有滤光片和光栅。在实时PCR扩增过程中，产物中的荧光物质被激发，仪器收集信号并将其转化为成为扩增曲线，用于之后的定性或定量研究。1. 荧光定量PCR技术的数学原理荧光定量PCR就是在PCR反应中掺入荧光染料，利用荧光信号的变化实时检测PCR反应中每一个循环产物量的变化；基于PCR反应的指数扩增期，Ct值和模板量存在线性关系，从而利用Ct值对起始模板进行定量分析的方法。为了理解荧光定量PCR的数学原理，我们必须要了解指数扩增期和Ct值所代表的意义。1.1 什么是指数扩增期？PCR反应分为3个时期：指数扩增期、线性期和平台期。理想的PCR反应，产物量应与循环数呈指数关系，用数学方程式表示为：Xn=X0×2n（n为PCR反应进行到第n个循环，Xn为PCR反应扩增到第n个循环时的产物量，X0为初始模板量）。指数扩增期是指在PCR初期，PCR反应中每一个循环的产物量与初始模板量符合这种指数关系的时期。随着反应不断进行，产物对PCR反应的抑制、taq酶的消耗的因素的影响，退火不仅仅发生在模板与引物之间，导致PCR反应的效率不断降低，PCR产物量与初始模板量不再呈现指数关系，PCR反应逐渐进入线性期。最终，PCR反应进入平台期，即PCR产物不再随着循环数的增加而增加。1.2 如何用Ct值计算初始模板量？首先我们需要了解荧光定量PCR中的几个重要概念：基线（baseline），阈值（threshold）和Ct值（Ct value）。一般来讲，第3-15个循环的荧光值就是基线，是由于此时期的荧光值较低、测量的偏差较大引起的。阈值一般设为基线期荧光值的标准偏差的10倍，代表PCR反应进入指数扩增期的要求。Ct值就是荧光值达到阈值时候的PCR循环次数。将指数扩增期产物与初始模板量间的关系方程Xct=X0×2ct取对数后经过整理，方程可最终转换为Ct=kLogX0+b。可见，Ct值与初始模板量的对数呈线性关系，这就是Ct值用来定量的数学原理。2. 荧光定量PCR技术的化学原理荧光定量PCR的化学发光原理可以分为2大类：一类为染料类，包括如SYBRGreen I、EvaGreen等，通过荧光染料来指示产物的增加；一类为探针类，包括TaqMan探针和分子信标探针等，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。2.1 SYBR Green法SYBR Green I是一种结合于双链DNA小沟中的染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强，这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBRGreen I的最大吸收波长约为497nm ，最大发射波长约为520nm。在PCR反应体系中，体系中的SYBRGreen荧光染料掺入DNA双链后发射出荧光，并且荧光的强度与体系中双链的浓度成正比，从而保证了荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，荧光的强度就代表了体系中双链产物的浓度。2.2 Taqman探针法Taqman探针是最早用于定量的方法。其原理是在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，不会检测到荧光；PCR扩增时，Taq酶的5－3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，也同样实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。3. 两种不同方法的特点及应用3.1 SYBR Green染料定量法的特点及应用优点：成本低，不需要探针；准备时间和实验时间短，操作简单；可以制作熔解曲线来确定PCR产物是否特异、有无引物二聚体。缺点：无法多重检测，只能检测一个目标基因；无模板特异性，只能给出总信号，对引物的特异性要求较高；灵敏度低，目的片段需在5000拷贝以上。应用：一般应用于相对定量分析。最适合初步筛查，即先用SYBR Green方法筛查，得到初步结果后再用TaqMan精确定量3.2 TaqMan探针法定量的特点及应用优点：特异性高，探针提供了额外的特异性；准确性高，可给出特异模板的荧光信号；可应用于多重定量。缺点：成本较高，合成探针费用较贵，等待时间长。应用：一般应用于绝对定量分析，MGB探针等可应用于SNP的检测。4. 荧光定量PCR和常规PCR的区别常规的PCR技术是对模板进行PC