酶标仪应用总结1-收光检测.pptVIP

生物大分子定量 Absorbance 260 nm Absorbance 280 nm 生物大分子定量 核酸定量（A260） 原理：核酸的嘌呤和嘧啶环含有共轭双键，对260nm左右的紫外光有较强的吸收；通过测量260nm的吸光值可计算出DNA、 RNA、寡聚核苷酸的浓度。 检测实验： 260/280 Ratio Test Direct dsDNA Quantitation Direct Oligonucleotide Quantitation Direct RNA Quantification Particulate Test A320 Phenol Test EDTA Inhibition Assay 核酸定量定量（A260） 260/280 Ratio Test： 用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是 280 nm。纯净的样品，纯的DNA A260/280比值为 1.8 ；纯的RNA A260/280比值为 2.0 。样品中如含有杂蛋白及苯酚，A260/A280比值即明显降低。 对于纯的核酸溶液，测定A260，即可利用核酸的比吸光系数计算溶液中核酸的量，通常以1OD值相当于50μg／mL双螺旋DNA，或40μg／mL单螺旋DNA（或RNA），或20μg／mL寡核苷酸计算。 Particulate Test A320：检查经纯化、离心后仍残留在溶液中的不溶性颗粒， 样本纯净时，扣除本底后的ODA320值应该为零。 Phenol Test：核酸样品的A260/A2701,当比值1时表示存在酚类污染， 酚类可使蛋白变性，影响酶反应活性。 EDTA Inhibition Assay：EDTA的存在会抑制二价金属离子，纯净DNA样 品的A260/A230 的比值应2.0, 小于2.0 时表示存在EDTA污染。 核酸定量定量（A260） DNA 我们知道，在260nm和1cm光路经下，1 OD 的DNA溶液的浓度是50 μg/ml OD=消光系数*样品浓度*光路径 微孔板 光路径？DNA浓度？ 光路径长度校正－无需标准曲线定量核酸 光路径长度校正 纯水在977nm下有一个非常强的吸收峰，在1cm比色皿中，其在977nm和900nm下的吸光度的差为0.18OD，而在此波长下其他物质是没有吸收的，因此可以巧妙地利用纯水的这一特性，来校正不同样品之间的光路径长度。 核酸样品溶液中肯定含有纯水，先测定微孔板中待测样品在977nm和900nm下的吸光度的差值ΔOD，然后根据以下公式计算出光路径长度b： 1cm 0.18 b ΔOD ＝ b ＝ 0.18 ΔOD 然后测定待测样品在260nm下的吸光度OD260nm，根据朗伯比尔定律表达式，即可计算出样品的浓度： CDNA ＝ × OD260nm 0.020 b ＝ 0.18 ΔOD OD260nm 0.020 × 光路径长度校正 * 核酸的嘌呤和嘧啶环含有共轭双键，对260nm左右的紫外光有较强的吸收；通过测量260nm的吸光值可计算出DNA、 RNA、寡聚核苷酸的浓度 * 核酸的嘌呤和嘧啶环含有共轭双键，对260nm左右的紫外光有较强的吸收；通过测量260nm的吸光值可计算出DNA、 RNA、寡聚核苷酸的浓度