实验三 细菌的简单染色与革兰氏染色生计.pptVIP

实验三 细菌的简单染色和革兰氏染色 细菌的简单染色和革兰氏染色 一 目的要求 二 基本原理 三 实验材料 四 无菌操作过程 五 操作步骤 六 实验报告 七 思考题 一 目的要求 （一）细菌的简单染色原理 （二）革兰氏染色基本原理 （二）革兰氏染色基本原理 三 实验材料 （一） 简单染色操作步骤 （二）革兰氏染色操作步骤 六 实验报告 * * 1 学习制染色片技术，学习简单染色\革兰氏染色原理，理解着色机理。 学习并掌握无菌操作的技术。 3 掌握简单染色\革兰氏染色的方法，并能正确染色 4 巩固显微镜油镜的使用方法。 二 基本原理 细菌细胞微小，且含水量较多，在普通光镜下表现为无色透明，不易观察，所以必须进行染色处理，使细胞着色，便于观察。 简单染色是使用单一染料染色，可用于观察细菌形态、大小、及排列方式. 染色前一般要将细胞固定，其目的是杀死菌体并使之粘附于玻片上，还可以增强菌体的着色能力。固定有加热法和化学法两种，无论采用何种方法均应维持细胞原有形态。 （一）细菌的简单染色原理 革兰氏染色是用于细菌鉴别的一种重要染色方法。它是根据革兰氏阳性细菌、阴性细菌细胞壁结构、组成的不同而使用一系列的染色处理使之差别显色。其染色方法是先将细菌分别用结晶紫和碘液初染媒染后，乙醇脱色，再经复染剂复染。最终被染成红色的是革兰氏阴性细菌；被染成紫色的是革兰氏阳性细菌。 革兰氏染色原理： 第一步：结晶紫使菌体着上紫色 第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在细胞内。 第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应。 G+ 菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。 Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，蕃红复染后呈红色。 1 2 3 4 ？ 大肠杆菌（24 h 培养）斜面菌种 枯草杆菌（16 h 培养）斜面菌种 四 无菌操作过程 无菌操作：不让除我们接种的微生物以外 其它微生物侵入的技术。 涂片：载玻片 无菌水 斜面菌种 无菌操作 均匀的薄层 2 干燥： 3　固定：加热固定 五 操作步骤 4　染色：结晶紫染1min 或蕃红染2-3min 或石炭酸复红 染1min。 5　水洗： 6 干燥： 7　镜检：低倍镜观察以确定目标和范围，再换用油镜观察绘图。 1　涂片：方法同单染色，然后干燥、固定。 2　初染：滴加结晶紫染色1min，后用水冲洗。 3　媒染：滴加碘液染色1---2min，后用水冲洗，甩尽残余水 4　脱色：用95%乙醇冲洗30秒（需要严格控制时间和浓度）， 然后立即用水冲洗。 5　复染：用蕃红或石炭酸复红覆盖涂片进行复染，蕃红染 2---3min，如果石炭酸复红染1min。水洗，晾干。 6　镜检：先用低倍镜观察，后用油镜观察 阳性菌 阴性菌 1 2 3 4 写出实验目的 2 写出简单染色、革兰氏染色的基本原理 根据实验结果绘出简单染色和革兰氏染色的结果图。 思考题：A如果对一未知菌进行革兰氏染色，如何能确证染色结果正确可靠？ C为什么说95%酒精脱色是革兰氏染色的关键步骤？ 下次实验内容： 实验四 微生物细胞大小的测定及显微镜下直接计数 菌名： 放大倍数： 细菌简单染色结果图 细菌革兰氏染色结果图 要求： 标出菌名、颜色、阳性或阴性菌 放大倍数： （1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云金杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的苏云金杆菌浓菌液挑2-3环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取2-3环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。 （2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。 （3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜） （4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1-2min。 （5）水洗：用水洗去涂片上的染色液 （6）