Lowry–Folin法测定液体样品中蛋白质含量.docVIP

Lowry–Folin法测定液体样品中蛋白质含量 　　一、实验目的 　　1、了解测定蛋白质的常用方法 　　2、掌握蛋白质含量测定的经典Lowry–Folin法。 　　二、实验原理 　　在碱性溶液中，蛋白质中的肽键与铜盐可产生双缩脲反应，产生络合物，此络合物会将磷钼酸-磷钨酸试剂还原，产生深蓝色复合物。在一定的条件下，蓝色深浅与蛋白质的量成正比。在波长540nm处测定样品的吸光度，与标准曲线对比，可确定其蛋白质含量。这种方法是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的经典方法之一。 　　三、实验步骤 　　1、标准曲线的绘制 　　(1)取10ml具塞试管6支，编号，分别准确吸取、、、、、血清蛋白溶液置于相应的试管中，在各试管中分别加入、、、、和的蒸馏水，使总体积达到。不同浓度BSA溶液的配置 　　编号012345 　　BSA 　　水 　　BSA质量04080120160200 　　(2)取试剂，试剂和试剂，在50ml三角瓶中混匀，在每只试管中分别准确加入此试剂，充分摇匀，静置15min. 　　(3)分别在各试管中准确加入Folin-酚试剂稀释液，立刻震荡，充分摇匀。 　　(4)静置30min，在540nm波长下测定每个试管中溶液的吸光度(A值)。 　　(5)以A值为纵坐标，BSA质量(即0~200μg)为横坐标，绘制标准曲线，求出回归方程和相关系数R2。 　　2、样品的测定 　　将啤酒样品适当稀释(20倍)，吸取2份，各，重复步骤1中的(2)~(4)。 　　四、实验试剂 　　1、试剂A：称取溶于1000ml(最终体积)/LNaOH中。 　　2、试剂B：称取CuSO4·溶于100ml(最终体积)蒸馏水中。 　　3、试剂C：称取酒石酸钾钠溶于100ml(最终体积)蒸馏水中。 　　4、牛血清蛋白(BSA)标准溶液：准确称取牛血清蛋白，配制成浓度为200μg/ml的溶液。 　　5、2mol/LFolin-酚试剂。 　　五、实验数据与处理 　　分组012345样品1样品2 　　吸光度 　　样品中蛋白质的含量(μg/ml)=XANⅩ 　　式中，XA——根据标准曲线计算出来的蛋白质量(对应稀释样品中的蛋白质浓度，μg/ml)N——样品的稀释度数(N=20) 　　计算：标准曲线y=+(R2=) 　　当y1=时，代入得x1=(μg/ml)样品1中蛋白质含量m1=/ml 　　当y1=时，代入得x1=(μg/ml)样品1中蛋白质含量m1=/ml 　　当y2=时，代入得x2=(μg/ml)样品2中蛋白质含量m2=/ml 　　平均含量：(+)/2=mg/ml 　　平均偏差：()/2= 　　相对平均偏差：/100%=% 　　六、实验注意事项 　　1、加入Folin-酚试剂后立即将反应液摇匀，以便Folin-酚试剂在碱性溶液中破坏之前即能被铜-蛋白质复合物还原。 　　2、短时间内反应液的颜色保持稳定，因此，静置30min后应立即测定吸光度，若拖延时间过长，颜色将会变化，影响测定结果。 　　七、思考题 　　1、测定食品中蛋白质含量的常用方法有哪些?其原理、适用性如何? 　　答：凯氏定氮法 　　原理：样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氮(消化)，氮又与硫酸作用，变成硫酸氢。经强碱碱化使之分解放出氢气，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品的氮含量，再乘以，即得样品中蛋白质含量，以甘氨酸为例，反应式为： 　　NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 　　2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 　　(NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+NaSO4+2NH3 　　适用性：用于标准蛋白质含量的准确测定，干扰少，费事太长;灵敏度低，适用于~氮，误差为±2%。 　　双缩脲法 　　原理：在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或连个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测量蛋白质含量。 　　适用性：用于快速测定，但不太灵敏;不同蛋白质显色相似;误差范围为1~10μg蛋白质 　　Folin-酚试剂法 　　原理：在碱性溶液中，蛋白质中的肽键与铜盐可产生双缩脲反应，产生络合物。此络合物会将磷钼酸-磷钨酸试剂还原，产生深蓝色复合物。在一定的条件下，蓝色深浅与蛋白质的量成正比。在波长540nm处测定样品的吸光度，与标准曲线对比，可确定其蛋白质含量。 　　适用性：耗时长，操作要严格计时;颜色深浅随不同蛋白质变化，灵敏度高;最低位0~5μg;通常测定范围是20~250μg;也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。 　　紫外吸收法 　　原理：蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含