TILLING(定向诱导基因组局部突变)技术原理和其路线.pptxVIP

TILLING（定向诱导基因组局部突变）技术原理及其路线 中国农业大学 齐孟文 TILLING是后基因组时代出现的，一种将烷基化试剂EMS或辐射诱导的位点突变技术，与特定基因的PCR扩增技术和突变单核苷酸多态性检测技术或下一代基因俘获高效测序技术相结合的反相遗传学方法。提供了一种几乎对所有物种都适应的、低成本、高通量和自动化的诱发突变筛选技术。该技术也可用于天然群体自发突变的筛选，称之为Eco-TILLING。 图.基因诱变组学的正向和反向遗传学操作的路标。 技术特点 点突变是随机分布的饱和突变，可获得大量的等位基因系列，对长度很小的基因，复等位基因等具有独特的反向遗传学技术优势。 诱变频率高，为筛选特定目的基因所需的突变群体小。 不依赖农杆菌介导转化或内源标签系统，无需耗时的基因操作和繁琐的组织培养。 但需要预先知道所研究基因的序列。 操作流程 操作流程 1）用甲基磺酸乙酯处理种子诱导位点突变； 2）播种诱变处理种子，按单株种植得到诱变M1代植株； 3）播种M1代种子得到诱变M2代植株，自交获得M2代种子并保存建库； 4）按单株提取M2代组织DNA，存放于96孔微孔板建库； 5）5-8倍混合单株DNA库，构建DNA样品池以增加扫描通量； 6）针对目标基因设计特异性引物，采用700nm和800nm荧光染料标记引物，对DNA目标区域进行PCR扩增； 7）PCR的扩增片段经变性、退火，得到野生型和突变型碱基错配的异源双链核酸分子； 8）用特异性识别并切割错配碱基的核酸内切酶celⅠ切割异源双链核酸分子，在错配位点单链的3端切开； 9）变性酶切产物得到完整单链(无突变碱基)和单链片段（突变点被切开所致）； 10）酶切产物采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离； 11）用Photoshop对凝胶进行图像分析，如某一泳道有突变带，则在700nm和800nm的图像中，均会在野生型条带下方看到一个新的条带，这2个条带片段大小之和等于野生型条带长度，由新增2个条带的移动距离可以大体上估计突变距目标区域5或3的距离； 12）回溯发现带有突变的DNA池对应的保存样品，重复5-11过程锁定突变单株。 TILLING分析过程。a. 1）使用荧光染料标记基因特异性引物，对DNA池进行PCR扩增；2）扩增产物经热变性，然后退火随机复性；3）形成的错配双链DNA分子用S1内切酶切割，然后变性；b.切割产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，以确定基因发生突变的DNA池。利用LI-COR凝胶系统的IRD700和IRD800两个通道测定5和3标记的PCR产物，产物大小可以确定突变点在扩增片段上的位置，在本例中大概离5端0.2kb，3端0.8kb的距离。 图.跑胶通道IRD800（左）和IRD700（右）的影像，诱变带被框出，IRD700中的截图标在最右边，注意一个通道的泳道浮现在背景上只有一个带，另一通道是相应的带，二者大小相加等于扩增产物的全长（最上端的带），胶下端泳道的若干的条带是随机错误引导所产生的小片段。 关键节点 1）诱变过程 诱发突变既可采用金典的化学诱变如EMS，也可以采用物理诱变如辐射诱变，或者利用自然突变群体。诱变过程应进行小规模的预实验，通过对诱变效率和致使效应的折衷，选择适合的诱变剂量。 ＥＭＳ是一种单功能烷化剂，在体内可以转变成缺电子的活泼中间产物，容易与碱基上的Ｎ原子和磷酸基团发生亲核取代反应，通过2条途径使基因突变。一是碱基的烷基化效应，鸟嘌呤（Ｇ）的Ｎ７位易被烷基化，形成带正电的季铵基团，产生２种可遗传的效应：１）促进Ｎ１上的Ｈ解离，使Ｇ与Ｔ配对，导致Ｇ：Ｃ转换成Ａ：Ｔ；２）削弱了Ｎ９位的糖苷键，发生脱嘌呤作用，如果脱嘌呤位点在ＤＮＡ复制之前未被修复，则该位点在复制时将随机插入任何一个碱基，经过一轮复制后，可能发生Ｇ：Ｃ到Ａ：Ｔ的转换，也可能发生Ｇ：Ｃ到Ｃ：Ｇ或Ｔ：Ａ的颠换；二是磷酸基团的烷基化效应，磷酸基上的Ｏ原子被烷基化后，形成不稳定的磷酸酯，容易发生水解，使核苷酸从磷酸与五碳糖间切断，导致ＤＮＡ断裂，产生染色体缺失。位点突变引起基因功能的改变主要包括：错义突变，无义突变和剪接突变。 2）突变群体 为了使突变能够产生分离表型变异，突变群体一般不选嵌合的M1代，而是选择突变M2代，但是若是花粉诱变则可以选择其M1代，如玉米品种。在知道诱变频率的情况，产生目标基因突变所需要的群体大小可以估算。 3）DNA池 为了提高分析通量，一般构建8倍的DNA样品池，如果品种的突变频率较高，突变群体较小时，样品池也可以较小。构建基因池时,要确保各个单株的DNA