质粒DNA的提取纯化与电泳检测课件.pptVIP

一.大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化 当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能复性而相互缠绕形成网状结构 通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 3 .DNA的纯化 根据实验要求不同，有时需要高纯度的DNA，对提取的DNA样品须进一步纯化并除去溴化乙锭(EB)。常用的DNA纯化方法有： 透析袋电洗脱法 适用于小剂量DNA纯化和酶切DNA片段回收。 DNA样品在琼脂糖凝胶电泳分带。 切取含待纯化DNA带的琼脂糖凝胶块，装入透析袋，进行电泳1-2h后，再反向电泳1-2min。 吸取透析袋中的洗脱液于离心管中离心。 转移上清液到另一离心管中，加入2倍体积无水乙醇混匀，于-20℃放置过夜沉淀后，离心后上清液，最后把沉淀物溶于TE缓冲液中，-20℃保存备用。 通过凝胶电泳回收的DNA样品和氯化铯-溴化乙锭连续梯度离心制备的DNA样品，因检测需要而含有溴化乙锭(EB)，会影响限制性核酸内切酶的切割，因此有必要去掉插入到DNA中的EB，常采用的方法有：正丁醇(或异戊醇)抽提或Dowex树脂层析法等。 DNA的浓缩 4.DNA的定量和纯度测定 DNA样品的浓度的测定，一般采用紫外光谱分析、EB荧光分析、水平式琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法和脉冲电泳法等。 紫外光谱分析法 紫外光谱分析法的原理基于DNA(或RNA)分子在260nm处有特异的紫外吸收峰且吸收强度与系统中DNA或RNA的浓度成正比。分子形状、双链与单链之间的转换也会导致吸收水平的改变，但是这种偏差可以用特定的公式来校正。该法的特点是准确、简便，但所需仪器较昂贵。 衡量所提取DNA的纯度可用OD260与OD280的比值,OD260/OD280对DNA而言其值大约为1.8。 当OD260/OD280大于1.8则可能有RNA污染。 当OD260/ OD280小于1.8时则有蛋白质污染。 EB荧光分析法 EB荧光染料能插入DNA或RNA的碱基对平面之间并结合在上面，在紫外光的激发下产生桔黄色荧光。由于结合于DNA分子之上的EB的量与DNA分子长度和数量成正比，则荧光强度可以表示DNA量的多少。 将标准DNA溶液按浓度由低到高分别与同样体积的EB溶液混匀在一块黑色的点样板上形成一个浓度梯度，然后将待测DNA也与同样体积的溴化乙锭混匀，最后将待测样品与标准品在紫外灯下发出的荧光强度进行比较，就能测出该样品总DNA浓度。 1.定义 ??聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。 在核酸的分析过程巾，除了涉及一般的DNA外还需要检测小相对分于质量的DNA或RNA。琼脂糖凝胶电泳对小相对分于质量的核酸分子的分辨李较低，而聚丙烯酰胺凝胶电泳可很好的分辨100 bp一1kb大小的核酸分子，对单链核酸来说，其分辨率可达l bp，这种分辨能力在DNA序列测定中发挥了重要作用。 优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。 聚丙烯酰胺凝胶浓度（%） 分离DNA片断大小（bp） 4.0 10.0 20.0 1000—100 500—25 50—1 琼脂糖凝胶电泳：1000——50000bp 聚丙烯酰胺凝胶电泳：1——1000bp ①聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起； ②链的纵横交错形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛的性质； ③网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有抗对流的作用； ④长链富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶； ⑤该结构不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。 DNA分子在琼脂糖凝胶中的泳动速率与其相对分子质量有关，在一定大小范围内泳动速率与相对分子质量成线性关系；当DNA片段的相对分子质量大于一定程度后(如40 kb)，其在常规凝胶电泳中的泳动速率主要与电场强度有关，而与相对分子质量的关系不显著。这样一来，常规电泳无法特大片段DNA按相对分子质量的大小进行区分。但是，通过脉冲场凝胶电泳可有效地分离大相对分子质量的DNA片段。脉冲场凝胶电泳是琼脂糖凝胶电泳的改进方式，是专门针对大片段DNA的分析检测方法，如50 kb或100 kb以上，甚至Mb级的大片段DNA，广泛应用于染色体分析和作图。 1.定义 横向交变电泳（TAFE） 场翻转凝胶电泳（FIGE) 旋转凝胶电泳 箝位匀场电泳（CHEF） 1.控制潜在RNA酶的活性 （1） 溶液和用具的去RNA酶处理 （2）RNA酶抑制剂的使用 2.RNA的抽提和纯化 （1） 酚—异硫