常用分析仪器使用与维护电子教案第五 高效液相色谱仪.pptVIP

第五章 高效液相色谱仪 第一节 高效液相色谱仪的结构 一、高效液相色谱仪的分类 二、高效液相色谱仪的结构 第二节 高效液相色谱仪的使用 第三节 高效液相色谱仪的维护与保养 * * 按色谱过程的分离机制分： (1)吸附色谱法 固定相为吸附剂，靠组分在吸附剂上的吸附系数（吸附能力）的差别而达到分离 (2)分配色谱法 固定相为液态，利用样品组分在固定相与流动相中的溶解度不同所产生的分配系 数差别而达到分离的 (3)空间排阻色谱法 采用凝胶作为固定相，依样品组分的分子尺寸与凝胶孔径间的关系即渗透系数的 差别而分离 (4)离子交换色谱法 采用离子交换树脂作为固定相，依样品离子与固定相表面离子交换基团的交换能 力（交换系数）的差别而分离 (5)亲和色谱法 利用蛋白质或生物大分子与固定相表面上配基的专属性亲和力进行分离 (6)化学键合相色谱法 将固定相的官能团键合在载体表面，所形成的固定相称为化学键合相 输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和色谱数据处理系统 组成: 高效液相色谱仪的组成 (一) 输液系统 1.贮液罐 存放洗脱液 2.高压输液泵 将液体送入液路系统 恒流泵 恒压泵 按其工作原理 3.流量控制装置 消除柱压过高对分离造成的影响 4.梯度洗脱装置 （二）进样系统 1.注射进样器 2.高压进样阀 六通高压进样阀工作示意图 （三）分离系统 色谱柱 装柱方法:湿法装柱和干法装柱 （四）检测系统 1．紫外吸收检测器 2.荧光检测器 荧光检测器 紫外吸收检测器 3．示差折光率检测器 反射型示差折光率检测器 4.电化学检测器 薄层安培检测器 （五）色谱数据处理系统 记录仪、积分仪或色谱工作站 一、高效液相色谱仪的检定 1．输液泵的检定 2. 色谱柱的检定 3．检测器的检定 连接 启动仪器 设定流量 记录 选择最灵敏挡 4．仪器测量精度的检定 5．仪器测量准确度的检定 二、高效液相色谱仪的主要操作提示 1.贮液器的操作 纯溶剂流动相不过滤，其它使用前必须用0.45μm的滤膜过滤 2.输液泵的操作 ①每次使用之前应放空排除气泡 ②更换流动相时一定要注意流动相之间的互溶性问题 ③如用缓冲溶液作流动相或已一段时间不使用泵，结束后先用超纯水或去离子水洗， 后用纯甲醇或乙腈冲洗。 ④不要使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲溶液 ⑤清洗溶剂过滤头 ⑥仪器使用一段时间后，卸下过滤器的压帽，取出密封环和烧结不锈钢过滤片一同清洗 ⑦使用缓冲溶液时，应该经常清洗柱塞杆后部的密封圈 ⑧如果泵长时间不用，必须用去离子水清洗泵头及单向阀 ⑨应定期更换密封圈 ⑩实验室应常备密封圈、各式接头、保险丝等 3.进样器的操作 ①样品瓶应清洗干净 ②使用平头进样针进样 ③自动进样器的针头应有钝化斜面 ④每次工作结束后应冲洗整个系统 4.色谱柱的操作 ①在进样阀后加流路过滤器 ②在流路过滤器和分析柱之间加上“保护柱” ③流动相流速不可一次改变过大 ④色谱柱应在要求的pH范围和柱温范围下使用 ⑤样品量不应过载，进样前样品应净化 ⑥应使用不损坏柱的流动相 ⑦每次工作结束后，应用强溶剂（乙腈或甲醇）冲洗色谱柱 ⑧柱子应定期进行清洗 ⑨色谱柱使用一段时间后，必须进行再生处理 ⑩对于阻塞或受伤严重的柱子，必要时可卸下不锈钢滤板，超声洗去滤板阻塞物 5.检测器的清洗 硝酸溶液（1＋4）超声清洗 纯水和甲醇溶液清洗 组装 6.色谱柱的装填 干法装柱 湿法装柱 湿法下行匀浆装柱示意图 7.色谱柱的平衡 纯乙睛或甲醇作流动相 低流速0. 2mL/min将色谱柱平衡过夜 色谱柱的填料充分平衡至最佳状态 流速增加到0. 8mL/min冲洗30min 8.色谱柱的再生 正相填料 反相填料 阴离子交换填料 阳离子交换填料 弱保留蛋白质凝胶过滤填料 强保留蛋白质凝胶过滤填料 三、高效液相色谱仪的一般操作程序 1.操作前的准备 ⑴配制足量的流动相 ⑵配制供试品溶液 ⑶检查使用记录本和仪器状态 2.泵的操作 流动相冲洗过滤器 过滤器浸入流动相 启动泵 开泵的排放阀 充泵排气 流速逐步回零或停止冲洗 关闭排放阀 调流速 3．UVD和色谱数据处理机的操作 开启检测器 选择光源、选定检测波长 设置吸光度方式和检测时间 开启色谱处理机 初步设定 进行检测器回零 记录基线 4．进样操作(六通阀式) 5．色谱数据的收集和处理 待最后一峰出完后，继续走一段基线，确认再无组分流出，方能结束记录 6.清洗和关机 关检测器和数据处理机 清洗色谱系统 关闭电源 四、Waters515型高效液相色谱仪的使用 1.Waters515型高