环境友好型杀重新基因挖掘和高效工程菌构建.pptVIP

环境友好型杀重新基因挖掘和高效工程菌构建 团队名称：cry基因研究小组 成员：魏司、冯艳、刘凯、杨娟 指导教师：夏立秋教授，莫湘涛副教授 项目简介 一、立项背景 苏云金芽胞杆菌（Bt.）是目前应用最广的生物杀虫剂，但随着其应用量的不断扩大，寻找新的高效、广谱杀虫菌株并克隆cry新基因，成为Bt.杀虫剂亟待解决的持续发展问题，已引起各国科学家的高度重视。该项目就是寻找cry新基因，获得杀虫效价更高的基因，可以丰富cry基因资源库，以利构建工程菌，为Bt.生物农药的发展奠定更好的基础。 项目简介 二、实施方案 1从土壤中分离Bt新菌株 2培养并筛选出毒力较高的菌株 3筛选并鉴定菌株基因型 4制备转基因工程菌并研究发酵条件 项目实施的进展情况及初步取得的创新成果 从湖南各地采取土样50份，其中来自长沙岳麓山土样20份，湘潭县石潭土样10份，常德桃源土样3份，娄底土样11份，株洲澧陵6份。制成斜面1000个，共筛选出11株菌株，总出镜率为1.1%。 项目实施的进展情况及初步取得的创新成果 Bt.菌株S002和S004的菌 项目实施的进展情况及初步取得的创新成果 Bt.菌株S003表达的晶体蛋白的AFM平面图 项目实施的进展情况及初步取得的创新成果 S1-1 S3-5 S2-1 S2-4 S5-4 S6-2 130kDa—— 100kDa—— 25kDa—— SDS电泳图 下一步计划及主要措施 生物测定： 以纯培养基做对照进行毒力测定，并根据复筛结果，鉴定出毒力较高的Bt菌株进行第二次毒力测定（设置多个浓度梯度）。 下一步计划及主要措施 Cry蛋白的鉴定： 取菌体进行碱液裂解,然后取1/2菌悬液高速离心法提取蛋白,取1/2菌悬液采取等电点沉淀法提取Bt蛋白,采用Lowry法测定晶体蛋白质浓度,采用恒流的方式将得到的Bt蛋白进行SDS考染10min,脱色后观察。再对其进行质谱鉴定分析，确定其核苷酸序列，以确定是否为新的毒素蛋白。 下一步计划及主要措施 Cry基因的鉴定： 采用SDS温和方法提取菌种质粒后，通过琼脂糖凝胶电泳检测其质粒带谱，预期将得到不同大小的质粒，并将其编号。通过序列同源分析找出cry基因的保守序列，设计出几对通用型引物，进行PCR扩增，然后用两种特异性内切酶消化扩增产物，经电泳分析，根据酶切片段的长度差异来确定菌株的基因型。 * *