测定蛋白质相对分子质量.pptxVIP

【目的要求】学习SDS测定蛋白质分子量的原理。 掌握垂直板电泳的操作方法。运用SDS测定蛋白质分子量及染色鉴定。【实验原理】电泳 带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。PAGE 聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和引发剂过硫酸铵(AP) 的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶作为支持介质的电泳称为PAGE。 PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。 CH2=CH CH2=CHC=O C=O NH CH2 NH C=O NH2( )n( )mCH2-CHCH2-CHCH2-CHCH2ˉ CHCH2-CHCH2-CHCH2-CH C=O NH CH2 NH C=O C=O CH2=CHC=OC=OC=ONH2NH2NH2NH2( )n( )mCH2-CHCH2-CHCH2-CH丙烯酰胺N, N’-甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺 PAG机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，改变 Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。 PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同.带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。【SDS基本原理】SDS是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级 结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解 聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。 有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的，它们在 SDS和巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此 这一类蛋白质，测定的只是亚基或单条肽链的MW。 蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。当蛋白质的分子量在17,000～165,000之间时， 蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系： lgMW = K - bm 将已知分子量的标准蛋白质在SDS中的电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。【操作方法】１、垂直板电泳槽 2、凝胶的制备 1）分离胶的制备 配制12%分离胶。在烧杯中依次加入重蒸水3.35ml,分离胶缓冲液2.5ml,10%SDS 0.1ml,凝胶储备液4.0ml，10% 过硫酸铵50ul和TEMED 10ul（两块胶的量？？？）。由于AP和TEMED相遇后凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液，用移液枪抽取3.2~3.5ml凝胶液加至长、短玻璃板间的窄缝内.再用注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水,用于隔绝空气，使胶面平整。37℃烘箱下聚合（约30 -60min）。待凝胶完全聚合.将贮槽的蒸馏水倒去 ，用细条滤纸吸去残留的水液。 2、凝胶的制备 2）浓缩胶的制备 配制3%浓缩胶。在烧杯中依次加入重蒸水3.12ml,浓缩胶缓冲液1.25ml,10%SDS 0.05ml,凝胶储备液0.6ml，10% 过硫酸铵 25ul和TEMED 5ul（两块胶的量？？？）。混匀后用注射器加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处(立即清洗注射器及针头)。 轻轻插入梳齿至浓缩胶内，避免带入气泡。约30min后凝胶聚合。 3、蛋白质样品的处理 1）标准蛋白质样品的处理 低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白MW=66,200 牛碳酸酐酶MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶MW=14,400 开封后，沸水浴中加热3-5min后上样。 2）样液的准备 用移液枪小心吸取处理好的血清50ul至1.5ml的离心管中，再加入50ul上样缓冲液，混匀后沸水浴中加热3min，取出冷却后加样。Staking gelSeparating gel4、加样 用移液器分别取10 ?l样品液，小心将样品加到凝胶凹形样品槽底部。5、电泳 将电泳仪的正负极与电泳槽正负极相连接，打开电泳仪开关，设置电压为110V，电泳80mins,此时溴酚蓝染料达到凝胶底部，停止电泳，关闭电源。6 、染色与脱色 电泳结束后，