耐酸高温淀粉酶菌株的基因诱变和筛选..ppt

耐酸高温淀粉酶菌株的基因诱变和筛选 答辩人：周雨薇 指导老师：王凤寰 耐酸高温淀粉酶菌株的基因诱变和筛选 文献综述 研究目的与意义 实验结果 总结与讨论 高温淀粉酶的用途： 啤酒酿造 制造味精 制糖工业 活性污泥处理 纺织退浆 高温淀粉酶三维空间结构 高温淀粉酶的性质 物理性质： 呈棕褐色液体 溶解性较好，易溶于水 PH范围：6.0-7.0 90~95℃时，仍能有效水解淀粉 化学性质： 糖源或淀粉为底物，从分子内部切开α-1.4糖苷键而使底物水解，其终产物为葡萄糖、还原糖、极限糊精和含四个以上葡萄糖残基的低聚糖。 淀粉的基本结构 基因诱变和筛选耐酸高温淀粉酶基因的意义 天然α-淀粉酶作用的pH范围一般为6.0~7.0，即pH在中性条件下，但是在生产生活中常常要求α-淀粉酶在偏酸性（5.2~5.6）条件下工作，因此要求重新构建耐酸高温淀粉酶菌株，使该菌株生产的α-淀粉酶适应酸性条件并能以高活性水解淀粉。 不同淀粉酶样品的凝胶电泳结果 将野生型淀粉酶与诺维信公司的耐酸性淀粉酶产品进行SDS比较，结果发现：蛋白质分子量大小相近，因此，影响pH稳定性的主要因素为基因的不同。 SDS 蛋白质电泳 1 2 3 4 5 6 7 8 9 实验流程图 载体PEASYTM-T3与ATCC14580地衣杆菌高温淀粉酶基因进行DNA重组 转化进入大肠杆菌感受态细胞 大提重组质粒 亚硝酸钠诱变并转化、培养 小提质粒，琼脂糖凝胶电泳观察质粒大小。 DNA纯化，保存遗传物质 基因测序 含有重组载体的大肠杆菌进行甘油保菌处理 重组载体转化进入地衣杆菌 在不同的低pH值LB培养基上筛选 实验结果 PEASYTM-T3载体与ATCC14580地衣杆菌的淀粉酶基因进行重组后转入大肠杆菌感受态细胞中并培养大肠杆菌感受态细胞，对大肠杆菌进行大提质粒，进行琼脂糖凝胶电泳。 重组载体pEASY-T3-amyl 3.0kb 2.0kb pEASY-T3-amyl 1kbmarker pEASY-T3-amyl 重组载体pEASY-T3-amyl ，经过亚硝酸钠诱变处理（15分钟和80分钟）并转化进入大肠杆菌感受态细胞培养，对大肠杆菌进行大提质粒。将提取出的遗传物质进行琼脂糖凝胶电泳。 3.0kb 2.0kb pEASY-T3-amylM15 1kbMarker pEASY-T3-amylM80 亚硝酸钠诱变的重组质粒pEASY-T3-amylM 实验结果 实验结果 含有未诱变质粒pEASY-T3-amyl的大肠杆菌在pH为5.6的LB培养基上生长，但无透明圈，无耐酸淀粉酶活性。 实验结果 含有pEASY-T3-amylM15的大肠杆菌，在pH为5.6的LB培养基上生长，产生的淀粉酶有耐酸淀粉酶活性。 实验结果 含有pEASY-T3-amylM80的大肠杆菌，在pH为5.6的LB培养基上生长，产生的淀粉酶有耐酸淀粉酶活性。 正向突变株的氨基酸序列分析 pEASY-T3-amylM15经测序发现共有7点突变： 第一点、第二点在信号肽内，无明显意义。 第三点：第4位：K→N赖氨酸（碱性）→天冬酰胺（中性） 第四点：第134位：R→L精氨酸（碱性）→亮氨酸（中性） 第五点：第288位：N→D 天冬酰胺（中性）→天冬氨酸（酸性） 有意义，影响大肠杆菌在低pH条件下产生淀粉酶。 第六点：第289位：F→Y苯丙氨酸→酪氨酸（多一个羟基） 第七点：第320位：A→S丙氨酸→丝氨酸（多一个羟基） 活性位点位于142、145、148处的His-X-Y-Gly-Z-W – Ser 正向突变株的氨基酸序列分析 2. pEASY-T3-amylM80经测序发现也有7点突变且与pEASY-T3-amylM15的7点突变一致。 结论 通过亚硝酸钠诱变技术，得到了含有有益氨基酸突变的（ K4N，R134L，N288D，F289Y，A320S）的高温淀粉酶； 含有突变的amyl基因的重组大肠杆菌能够在pH5.6的条件下产生高温淀粉酶并显示出酶活。 讨论与建议 亚硝酸钠作为诱变剂，可以使遗传物质发生突变。如果需要增加突变率，可以适当提高亚硝酸钠的浓度。 改良诱变剂 激光与亚硝酸钠结合：激光诱变具有操作简单、安全、变异率高、辐射损伤轻等优点。而激光与亚硝酸钠诱变剂的复合处理也具有潜在的诱人的诱变效果。 微波与亚硝酸钠结合：微波与亚硝酸钠诱变剂结合，会导致大肠杆菌对数期的变异率比稳定期高，霉菌萌发孢子的变异率低于未萌发孢子，原核生物的诱变率高于真核生物。 定点突变，通过蛋白质结构分析，进行理性设计及突变，筛选改良基因。 谢谢