离子交换层析分单核苷酸085.pptVIP

实验四 离子交换层析 分离单核苷酸 目的要求  通过以强碱性离子交换树脂分离单核苷酸， 学习和掌握离子交换层析的原理和操作方法。 离子交换层析的基本原理 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同进行分离纯化的层析方式。 RA+B＋ RB＋A+(RA是阳离子交换剂，B为溶液中的离子或待分离的生物分子） 平衡装柱 离子交换剂带上反离子(R-O-X+) 上样 样品（A＋, B+ ，C+，等）与反离子（X＋）竞争与电荷基团结合；（结合力A＋ B+Y+C+X＋） 洗脱 洗脱液中的离子成分（Y＋）与样品(A＋等）竞争结合电荷基团，首先C洗下来，随着Y＋浓度增加，B＋洗脱出，最后A＋出来，使样品分离。 所以从上样到洗脱都是根据结合力的大小进行进行的。洗脱液的选择很重要，要使有效成分和杂质分离。 离子交换层析分离单核苷酸的原理 1. 单核苷酸的结构 碱水解使核酸降解为2’或3’单核苷酸混合物，在2‘，或3’位带磷酸基团。 　　3. 2’，3‘单核苷酸等电点的差异 　由于2’和3’核苷酸的磷酸基团与碱环的距离不同，所以碱环上碱基基团的pK值有区别，所以2’和3’核苷酸的PI值有区别。2’核苷酸的PI值略高于3‘核苷酸的等电点。所以每种单核苷酸洗脱时出现2个峰。 离子交换层析分离单核苷酸的原理 4. 离子交换剂的类型 所用的离子交换剂为阴离子交换树脂，所带电荷基团为季铵基。 离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤 1）样品的获得 以KOH 37°C水解酵母RNA，生成2’－或3‘－核苷酸混合物。最终pH值调到8.0（注意核苷酸所带电荷！）。具体操作见讲义p23。 2)交换剂的平衡和装柱 以甲酸钠溶液平衡，反离子为甲基（COO-）。具体步骤见讲义p23。 　3）加样 以滴管加入1.0ml样品，以3－4d/min 的速度让其进入层析柱。然后以200ml ddH2O洗柱至OD2600.02。 离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤 　　4）洗脱并检测 依次用以下溶液分段洗脱：250ml 0.02mol/L甲酸； 250ml 0.15mol/L甲酸； 250ml 0.01mol/L甲酸－－0.05mol/L甲酸钠溶液（pH4.44); 250ml 0. 1mol/L甲酸－－0.1mol/L甲酸钠溶液（pH3.74);流速1ml/min。 收集洗脱液，10ml一管分别进行紫外检测，并记录吸收值。 离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤 5) 分析检测 a. 根据记录的紫外吸收值，分别做出分步洗脱曲线(如图所示）。 离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤 b. 保留各组分的洗脱高峰管，作出各组分在230－300nm波长范围内的紫外吸收光谱图（如图所示）。 思考题 通过实验操作，讨论有哪些因素会影响离子交换层析作用的的效果？ * * 树脂 － N+(CH3) — OH- 离子交换层析的基本原理 离子交换剂由基质、电荷基团（或称功能基团） 和 反离子组成。基质一般是不溶性聚合物，如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等； 纤维素－O — CH2— COO-— Na＋ 基质 电荷基团 反离子 离子交换层析的基本原理 当[A+]=[B+],[RB][RA], 说明 R－ 与B＋的结 合力比A＋大；反之亦然。 对于两性蛋白而言，结合力取决于其等电点以及 溶液的pH值。 离子交换层析的基本步骤 离子交换层析的基本步骤 2. 阴离子交换层析分离单核苷酸的依据 单核苷酸为两性电解质，几种单核苷酸的等电点 AMP 2.65 GMP 2.35 CMP 4.5 UMP 1.55 按等电点由高到低：CMPAMPGMPUMP 但是由于树脂对嘌呤的吸附力大于对嘧啶的吸附，所以洗脱顺序是 ：CMP-AMP-UMP-GMP 如果以阴离子交换剂分离，洗脱顺序是： CMPAMPGMPUMP 离子交换层析分离单核苷酸的原理 离子交换层析分离单核苷酸的原理 树脂 － N+(CH3)3－ * *