环境中抗生素性基因污染的初步研讨.pdfVIP

环境中抗生素抗性基因污染的初步研究 专 业：分析化学 硕士生：朱春敬 指导教师：邹世春副教授 摘要 近年来，排放到环境中的药物及其潜在的影响引起了越来越多的科学家的关 resistance 注。抗生素抗性基因(Amibioticgenes，ARGs)导致的对抗生素有抗性 的病原体的传播是本世纪对人类健康生活最严重的威胁之一。ARGs在环境中的 持久性残留，以及在不同环境介质中的迁移、转化往往比抗生素本身的环境危害 更大。抗生素的大量使用，使水环境不仅成为耐药基因的储库，也成为耐药基因 扩展和演化的媒介，因此需要特别加强水环境中抗生素抗性基因的环境行为研 究。目前国内对于ARGs的危害性还未给予应有的重视，有关ARGs的研究大多集 中于临床微生物中抗性基因的定性分析方面，很少见到环境介质中触犯s定性及 定量分析的报道。有鉴于此，加强环境中抗生素抗性基因污染及传递机制等方面 的研究，从而寻找有效措施阻止√搬Gs的产生及其在环境中的广泛传播是一项十 分紧迫的任务。 本论文的目的是建立环境中抗生素耐药性检测及抗生素抗性基因(ARGs) 的存在和含量水平分析的方法，初步调查珠三角水环境中细菌耐药性现状及 ARGs的存在和含量水平。主要研究内容包括：1)使用抗生素抗性培养基筛选的 方法调查北江水域四环素、红霉素及磺胺类抗生素耐药性细菌的存在；2)使用 聚合酶链反应(PCR)以及基因测序的方法来探测几种四环素、红霉素及磺胺类 ARGs的存在；同时，3)采用荧光定量PCR对s讲』和s甜陀这两种磺胺类抗性基因 进行进一步定量分析，以获得其污染水平。 本研究选取了具有代表性的9个采样点来调查珠三角水环境中细菌耐药性 现状及抗性基因的存在和含量水平。具体研究结果如下： 1．采用抗生素抗性培养基筛选法，研究了珠三角水环境中细菌对四环素、红霉 素及磺胺类抗生素的耐药性情况。抗性培养基的终浓度分别为，四环素，50 mg／L；红霉素，18ml扎；磺胺二甲嘧啶，280mg／L。在所研究的9个水样 中，8个水样对磺胺二甲嘧啶有耐药性，5个水样对四环素有耐药性，7个水 样对红霉素有耐药性；而所有对照实验结果均为阴性。这些实验结果表明， 该方法可用于水环境中细菌耐药性检测，所获得的样品耐药性结果表明该研 究水域细菌耐药性情况比较严重。 2．使用聚合酶链反应(PCR)方法深入研究了几种四环素、红霉素及磺胺类等 三类不同类别抗生素抗性基因的存在。经定性PCR实验证实其中5个样品 含有磺胺类抗性基因s“，，，4个样品含有磺胺类抗性基因s“陀。 3．对PCR产物进行基因测序，以进一步确定是否为目的基因。基因测序结果 进一步证实4个样品含有szf，J目的基因，2个样品含有s”眩目的基因。所有 基因测序均通过正反链测序证实，测序结果与目的基因的匹配度在98～100％ 范围内，同时，作为荧光定量PCR内参的16S—rI矾A基因亦经克隆测序证实。 故可以十分肯定地表明水样中存在磺胺类抗性基因的污染。 4． 国内首次采用荧光定量PCR方法对s甜，J和s“眩两种磺胺类抗性基因进行了 定量分析，获得了北江一些水样AI埝s的污染水平。定量PCR结果显示，7 个样品中s甜，J和s甜眩均有检出。s甜，J与16S．r心A表达量的比值在0．002729～ 0．305484范围内，szf您与l 内。实验结果显著高于美国科罗拉多州北部河流的检测结果，说明所研究的 北江水域受磺胺类抗性基因s讲J和s甜眩污染较严重。实验结果还表明，ARGs 的含量水平与人类活动及区域抗生素含量分布具有一定的相关性。 关键词：抗生素抗性基因，耐药性，PCR，荧光定量PCR，珠三角水环境 Ⅱ onthe of antibioticresistance Primarystudy poUution in