ACE2对脂多糖损伤人脐静脉内皮细胞的抗黏附作用.docVIP

关于本论文学术方面的意见： 为何设置氯沙坦钾组、A779组的意义未能阐明清楚。补充内皮细胞损伤模型建立依据。 说明进行LPS处理时，浓度选择1000ng/mL、时间点选择 6h的依据。补充ACE2蛋白表达的相关结果。ACE2具有一定抗黏附作用 的证据不够充分，只能说二者之间有关联，谁是因谁是果的证据还不够明确。 以上意见修改之后，请在此方框里对修改情况和争议处一一作出说明！１、答：因为原计划阻断ACE2以观察ICAM-1的含量变化，以便从反面论证，并弄清ACE2是否存在于ICAM-1的上游，是否是引起ICAM-1含量变化的原因。但是因为ACE2的特异性阻断剂Ｍ２Ｎ－４７６０市场上买不到，所以分别设置氯沙坦钾组以阻断ACE2的代谢产物AngⅡ，设置A779组以阻断ACE2的代谢产物Ang1-7，并分别观察AngⅡ及Ang1-7被阻断后，ICAM-1的含量变化，以便从反面观察ACE2的主要代谢产物AngⅡ及Ang1-7与ICAM-1的关系，从而得到ACE2对ICAM-1的间接作用。2、答：讨论部分第一段最后三句话已对LPS处理时选择1000ng/ml及6h作为造模条件做了阐述。首先THP-1黏附实验结果显示细胞黏附数呈LPS处理浓度依赖性增加，在1000ng/ml时大最大效应。其次即文献[9]《Lack of proinflammatory effects of free fatty acids on human umbilical cord vein endothelial cells and leukocytes》中“HUVEC experimental design”中第一段第5句话“The time points were chosen after performing pilot experiments showing maximum adhesion molecule expression after 6-8hr LPS incubation, followed by a decline towards 24h.”表明在HUVEC与THP-1黏附过程中起决定因素的黏附分子，在静息状态中呈低水平表达，经LPS处理后其表达急剧增加，在6-8h时达最大值，并持续至24h后下降。而本文实验结果也显示在LPS处理6h时，单核细胞黏附数已较空白对照组显著增加。由以上两点决定选择1000ng/ml LPS处理6h作为内皮细胞损失模型建立的条件。3、答：修改后的文章，已在“材料与方法”中“1.5 Western Blot检测ACE2的蛋白表达水平”及“结果”中“2.3 血管内皮细胞中ACE2的蛋白表达”处补充了ACE2蛋白表达相关方法及结果。4、答：首先本实验结果显示：ACE2蛋白及基因表达水平显著降低的模型组较空白对照组的ICAM-1蛋白含量显著降低，表明ICAM-1含量的增加与ACE2表达上调相关联。其次ACE2的主要生理功能是将AngⅡ讲解为Ang1-7，即减少AngⅡ的含量，增加Ang1-7的含量。 再次，本实验结果显示：AngⅡ含量显著升高的模型组较空白对照组的ICAM-1含量显著升高。且用氯沙坦钾预处理，特异性阻断AngⅡ与AT1受体结合，阻止其下游信号通路激活后，ICAM-1的含量较模型组显著降低。经以上正反两面论证后，表明ICAM-1在AngⅡ的下游，且，AngII升高可引起ICAM-1升高。该结论与参考文献[18]《AngiotensinⅡ stimulates intercellular adhesion molecule-1 via an AT1 receptor/nuclear factor-kappaB pathway in brain microvascular endothelial cells》中AngⅡ通过激活NF-κB信号通路，上调ICAM-1在人脑微血管内皮细胞中的表达的结论相一致。最后，本实验结果显示：Ang1-7含量显著降低的模型组较空白对照组的ICAM-1含量显著升高。且用A779预处理，特异性阻断Ang1-7与Mas受体结合，阻止其下游信号通路激活后，ICAM-1的含量较空白对照组显著升高。经以上正反两面论证后，表明ICAM-1在Ang1-7的下游，且，Ang1-7升高可引起ICAM-1降低。该结论与参考文献[19]《》中Ang1-7含量升高的慢病毒转染ACE2过表达间充质细胞中ICAM-1含量显著降低的结论相一致。由以上四点充分得出以下结论：ACE2上调后，通过降解引起ICAM-1含量增加的AngⅡ和生成引起ICAM-1含量减少的Ang1-7，间接地减少ICAM-1含量。其他格式、撰写方面的意见仔细阅读以下批注后一一修改！存在争议且不做修改的地方，保留批注并在批注中解释：ACE2对脂多