FCM 在精子相关疾病检测中应用.docVIP

1 ．1 　白细胞精子症的分析　１９８７ 年世界卫生组织（WHO）规定，将每毫升精液中的白细胞大于１００ 万的不育患者称为白细胞精子症。目前，白细胞精子症导致的不育已达到２０％ ，严重影响男性生殖健康。而一直以来，各实验室对精液中白细胞的判断标准不统一，严重影响白细胞精子症的诊断和治疗。因此建立规范的精液白细胞检测方法具有重要的临床意义。FCM 检测是利用白细胞表面的特异标志，用结合荧光染料的抗白细胞及其亚群的单克隆抗体将白细胞标记，然后通过流式细胞仪进行检测和分析。相比于直接镜检、过氧化物酶染色等其他检测手段，FCM 可准确区分白细胞与生精细胞，快速获知精液中白细胞含量，操作简便，结果可靠，且可进一步区分白细胞各亚群。1 ．2 　生精细胞凋亡检测　细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育、维护内环境稳定、由基因控制的细胞主动死亡过程。研究表明细胞凋亡的失控与许多疾病的发生有关，包括不育症。生精细胞凋亡的检测方法可采用电镜法或末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧核苷酸原位末端标记法TUNEL 等，但这些方法操作较繁琐、主观性大，不宜常规使用。现在通常用Annexin V２FITC／ PI 双标记后上流式细胞仪检测生精细胞凋亡情况。FCM 检测精子凋亡是一种迅速、准确、客观、可靠的评估精子功能和男性生育力的新方法［２‐３］ 。1 ．3 　DNA 倍体分析　细胞成熟程度与DNA 含量密切相关。初级精母细胞含有四倍体量的DNA（４C ） ；经过第一次减数分裂得到的两个次级精母细胞，虽然染色体的数目减半，但由于每条染色体是由两条染色单体组成的，因而其DNA 含量与精原细胞相同，均为二倍体量的DNA（２C） ；次级精母细胞经第二次减数分裂所形成的精子细胞，其每条染色体仅为１ 条染色单体，DNA 含量相当于初级精母细胞DNA 含量的１／４（１C） 。正常生育男性精液中均为１C 细胞，而由于精子发生障碍所致不育男性精液中出现大量２C 和４C 细胞。测定单个细胞内DNA 含量是FCM 最早、最基础的用途。在男性不育症的研究中，尤其是少精子症和无精子症的诊断、疗效和预后估测中，使用FCM 具有明显优点。FCM 对精液中细胞进行DNA 倍体分析表明，单倍体细胞峰１C 主要由精子细胞和精子组成，二倍体细胞峰２C 由精原细胞、次级精母细胞和支持细胞组成，四倍体细胞峰４C 主要由初级精母细胞和处于G ／M 期的精原细胞组成。因此FCM 是检测精子发生障碍的有效手段 。1 ．4 　线粒体功能检测　线粒体能够为精子运动提供三磷酸腺苷，是精子的能量供应中心，其功能状态直接影响精子的活动力。因此线粒体功能异常也是导致精子功能缺陷的重要病因之一。用罗丹明Rhodamine１２３（Rh１２３） ，Rh１２３ 和PI 双染结合FCM 可以检测精子线粒体功能。FCM 检测，可将精子分为３ 群：死精子（PI＋ Rh１２３ － ） ；线粒体功能良好的精子（PI ‐Rh１２３ ＋ ） ；线粒体功能丧失的活精子（PI － Rh１２３ － ） 。在FCM 检测过程中，绿色荧光的强弱反应线粒体的功能，荧光越强，说明线粒体功能越好，精子活动力越强；反之精子活动力弱甚至缺乏。1 ．5 　顶体状态检测　顶体结构及功能与妊娠率显著相关，正常的精子顶体及顶体反应是精卵结合的必要条件。传统的顶体检测方法技术要求较高，操作复杂，难以推广应用。而FCM为研究精子顶体结构的完整性及顶体反应能力提供了新的方向。异硫氨酸荧光素（FITC）标记的花生凝集素PNA 能特异性地标记在顶体膜上，其荧光强度可反映顶体大小，因此通过测定荧光强度可间接反映顶体结构的完整性。如果顶体内容物丢失，与PNA 结合的活性降低或消失，FITC 标记的荧光也会消失［６］ 。1 ．6 　精子质膜完整性检测　精子质膜损伤会影响精卵结合，从而导致不育，因此精子质膜的完整性是检测精子质量的重要指标之一。PI 和SYBR‐１４ 是用于质膜完整性检测的最常用的荧光染料。PI 只能进入质膜被损的精子，呈红色；SYBR‐１４ 可以进入细胞膜完整的精子，呈绿色。样品经流式细胞仪检测可得３ 种亚群： ① 被SYBR２１４ 染成绿色的活精子，并且比死精子亮；② 被PI 染成红色的死精子；③ 同时染上并发出两种荧光的双阳性精子，正处于从活向死的过渡状态［７］ 。