PCR―DGGE法在水体微生物多样性研究中应用.docVIP

PCR―DGGE法在水体微生物多样性研究中应用 　　摘要： 微生物无论在地表水生物圈物质循环还是能量流动中的地位都是不可替代、举足轻重的，在湖泊生态系统中也起着非常重要的作用，是表征水体富营养化的主要原因之一。本文主要讨论拟将基于16S rDNA的PCR-DGGE（变性梯度凝胶电泳）技术应用于水体微生物多样性研究，进而控制预防水体富营养化。 　　Abstract： The position of microbial in surface water biosphere material circulation and energy flow is irreplaceable and vital， also plays a very important role in the lake ecosystem， and is one of the main reasons of characterization eutrophication. This paper discusses that intending to apply 16S rDNA-based PCR-DGGE technology into the study of microbial diversity in water， thus preventing and controlling eutrophication. 　　关键词： 微生物多样性；变性梯度凝胶电泳（DGGE）；16S rDNA 　　Key words： microbial diversity；denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE）；16S rDNA 　　中图分类号：Q938.8 文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2014）19-0305-02 　　1 湖泊水体系微生物生态学 　　1.1 湖泊水体系微生物多样性 ①藻类，常见的藻类约56个属138个种，包括：硅藻、裸藻、金藻、甲藻、小球藻属，栅列藻属，以及蓝细菌等。②细菌，在被研究水体中BOD符合负荷值比较低、维持好氧状态的富营养话水体中，常见的优势菌群有芽孢杆菌属、假单胞菌属、产甲烷菌属、光和细菌属、硫酸盐还原菌等。③原生动物及微型后生动物，富营养化水体中常见固着型纤毛虫、鞭虫、甲壳类、摇蚊幼虫等。 　　1.2 湖泊水体系微生物间的相互关系 位于食物链中的各种生物与其生存环境间通过一系列的能量和物质的转移与循环保持着相互依存的稳定关系，即生态平衡。但当湖泊水体系中大量累积N、P等营养元素时，生态系统的平衡就被破坏，主要表现为藻类通过大量繁殖，数量明显增多，进而导致水体透明度下降和臭阈值增加。经过反复试验验证，向湖泊水体系中投加复合细菌能与原有水体中微生物形成共生增殖关系，从而使藻类优势种群无法形成，起到了强化水体生物自净能力，恢复湖泊生态平衡的作用。 　　2 微生物多样性分析的常用方法 　　2.1 水体微生物多样性的传统研究方法 水体微生物多样性的传统研究方法是先将被检测水体样品中的微生物进行分离培养，经过纯培养后获得纯菌株，再研究纯菌株的特征及细胞性质，最后总结特性。但由于微生物形态简单，个体较小，仅依靠外观形态观察无法获得太多信息，且自然界中大多数微生物无法依靠纯培养分离，也不能精确鉴定分离物，进而揭示分离物间的系统发育关系。 　　2.2 分子生物学技术 应用分子生物学技术研究水体微生物生态学，能够在一定程度上避免微生物多样性丢失及种群构成变化等问题的发生，有利于被研究水体微生物中新的菌株、新菌种的发现，进一步提高对环境微生物多样性的认知水平。 　　3 应用PCR-DGGE技术进行水体微生物多样性检测的原理、步骤和主要优缺点 　　3.1 应用PCR-DGGE技术进行水体微生物多样性检测的原理 本论文拟采用基于凝胶中不同DNA片段电泳迁移率差异的变性梯度凝胶电泳DGGE技术分离被研究水体系微生物的DNA。 　　如图1将尿素和甲酰胺等DNA变性剂添加到聚丙烯酰胺凝胶中，使溶液呈现线性的变性剂浓度梯度变化。在电泳过程中水体微生物的DNA双链分子在变性凝胶中逐步进行解链，形成解链区域，此接连区域的形成增大了DNA分子的迁移阻力。当到达一定变性剂浓度，水体微生物的DNA分子在变性凝胶中的解链程度恰好合适，DNA分子所受到的迁移阻力与周围电场力互相平衡时，DNA分子便停留在该变性浓度的聚丙烯酰胺凝胶中。DNA双链分子由于碱基排列顺序不一样解链区域及解链行为也不相同，导致虽然处于同种变性凝胶电泳环境中，其迁移行为也不一致，因此可以在其周围电场作用下得到分离。 　　为了提高被研究水体样品中微生物多样性的检验精确度和检出率，能够更好的反映被检测水体微生物的实际情况，彻底分离DNA片段，在PCR扩