荧光定量PR技术专题.pptVIP

1、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70℃ ，30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60℃ 2、反应参数的确定： 一般为：94 ℃，10-20S 60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：100-900nM 探针浓度：50-300nM 4、其他与常规PCR相同 相对定量分析方法 比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化！ 关注点：基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！ 通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。 TIANGEN公司荧光定量产品优势 试剂盒中使用改良后的Hotmaster Taq Polymerase，具有高效率、高灵敏度、高特异性特点 多种不同的实验缓冲液，满足不同实验需求 高效的Quant系列逆转录酶，满足RT需求 独特的Mg2＋自动调节，随时保证为PCR提供最佳Mg2＋浓度 TIANGEN公司荧光定量产品 SYBR Gre