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实验6 细胞冻存与复苏 1- 细胞冻存操作步骤 准备 冻存液（完全培养基配制的10%DMSO 溶液）配制 对数生长期细胞的吹打（消化）、收集、离心和计数（或估算） 1000rpm6min，去上清 用冻存液悬浮细胞使密度在～106/ml 左右 分装到冻存管 用记号笔在冻存管上加写标识（细胞株号+日期+操作者） 无菌分装到1.8ml 冻存管，装量0.5～1.0ml/支 冻存 直接放入超低温冰箱（-76 ℃ ），记录放置的具体位置 一般需要放入液氮内（-196 ℃ ）内冻存 『超低温冰箱』 制冷系统 基本采用复叠式制冷的工作原理，选用两台全封闭压缩机作为高、低温级压缩机使用 外观 卧式，立式 -86℃超低温冰箱使用 使用90～95%能力，以延长机器寿命；设置使用温度为-76℃ 影响保温的因素：门霜和冰块 使用过程中，温度升高到-60℃时必须关闭箱门 2- 细胞复苏操作步骤 准备 超净工作台消毒灭菌，无菌器材准备 准备37℃水浴 明确冻存细胞所在冻存管的存放位置，确认冻存18~24h以上 融化 在水浴中充分搅拌使在～1min 融化彻底 离心去除冻存液 无菌操作，10×体积的培养基稀释，1000rpm6min，去上清，分散沉淀 重新悬浮 用5×体积的完全培养基悬浮细胞，铺放培养孔或培养瓶内，镜检 培养与观察 用记号笔加写标识，镜检观察 置CO2 培养箱内，培养18～24h后镜检细胞活性 3-