基因操作与克隆载体课件.pptVIP

DNA的损伤原因： 1.DNA分子的自发性损伤 (1) DNA复制中的错误 (2) DNA的自发性化学变化 a.碱基的异构互变 b.碱基的脱氨基作用 c.脱嘌呤与脱嘧啶 d.碱基修饰与链断裂 2.物理因素引起的DNA损伤 (1) 紫外线引起的DNA损伤 (2) 电离辐射引起的DNA损伤 a.碱基变化 b.脱氧核糖变化、 c.DNA链断裂 d.交联;复习;DNA的修复系统 (一)回复修复 1.光修复 2.单链断裂的重接 3.碱基的直接插入 4.烷基的转移 (二)切除修复(excision repair) (三)重组修复(recombinational repair) (四)SOS修复;1． 转座子的分类和结构特征 a. 简单转座子 转座子（transposon，Tn）是存在于染色体DNA上可自主复制和移位的基本单位。 最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称为插入序列（insertion sequence，IS），它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。一个细菌细胞常带有少于10个IS序列。转座子常常被定位到特定的基因中，造成该基因突变。IS序列都是可以独立存在的单元，带有介导自身移动的蛋白。 b.复合式转座子（composite transposon）是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。一旦形成复合转座子，IS序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只能作为复合体移动。;2、转座作用的机制 转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段很短的（3-12bp）、被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。不同转座子的靶序列长度不同，但对于一个特定的转座子来说，它所复制的靶序列长度都是一样的，如IS1两翼总有9个碱基对的靶序列，而Tn3两端总有5bp的靶序列。 转座可被分为复制性和非复制性两大类。 在复制性转座中，所移动和转位的是原转座子的拷贝。转座酶（transposase）和解离酶（resolvase）分别作用于原始转座子和复制转座子。TnA类转座主要是这种形式。 在非复制性转座中，原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位，IS序列、Mu及Tn5等都以这种方式进行转座。;转座子的应???;;;二、限制性内切酶;二、限制性内切酶;二、限制性内切酶;二、限制性内切酶;二、限制性内切酶;二、限制性内切酶;二、限制性内切酶;二、限制性内切酶;二、限制性内切酶;二、限制性内切酶;二、限制性内切酶;Klenow片段（克伦诺片段，Klenow fragment）：E.coli DNA聚合酶I经部分水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。该片段保留了DNA聚合酶I的5ˊ-3ˊ聚合酶和3ˊ-5ˊ外切酶活性，但缺少完整酶的5ˊ-3ˊ外切酶活性。 它可用于填补DNA单链末端成为双链。 a、用于同位素标记DNA片段末端 b、合成cDNA的第二条链 c、Sanger双脱氧法进行序列分析 d、定位突变;二、限制性内切酶;二、限制性内切酶;三、其他常用的工具酶;三、其他常用的工具酶;4、Tag DNA聚合酶 ? 是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，具 有5’ 3’聚合酶活性，该酶最适反应温度为 75~80 0C，主要用途是进行PCR反应。 5、逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶） ? 主要作用是将mRNA反转录成cDNA;（二）T4噬菌体DNA连接酶 该酶的作用是一个DNA片段的5’- P与另一DNA片段的3’- OH连接成磷酸二酯键。 ACG-OH P-AATTCGT TACTTAA-P OH-GCA -ACGAATTCGT- -TGCTTAAGCA;（三）碱性磷酸酶 ? 其作用是去除DNA、RNA的5’磷酸根（ 5’-P）， 以防自身环化；另外在用32P标记5’末端前，可先 用其去除DNA或RNA上的5’- P。;四、常用的载体;四、常用的载体;四、常用的载体;四、常用的载体;四、常用的载体;（2）质粒DNA的构型 ? SC(CCC covalently close circular DNA )构