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第三章 细胞生物学研究方法 显微镜之于生物学，犹如望远镜之于天文学，细胞生物学的变革无不和显微技术的改进息息相关。 1590年J. 和Z. Janssen父子制作第一台复式显微镜，放大倍数不超过10倍。 1932年德国学者Max Knolls 和Ernst Ruska发明了第一台电子显微镜 研究技术、研究工具促进细胞生物学科的发展 显微镜的出现——细胞学说的建立 电子显微镜技术——进入超微与分子形态水平 超离心技术 细胞成分、代谢过程的 同位素示踪技术 精确定性、定量分析 单克隆抗体、分子杂交——生物工程 第一节细胞形态结构的观察方法 一、光学显微镜技术 二、电子显微镜技术 三、扫描隧道显微镜 一、光学显微镜技术 1、普通复式光学显微镜技术 2、相差显微镜技术 3、荧光显微镜技术 4、激光共焦点扫描显微镜技术 1、普通复式光学显微镜技术 1）光学显微镜的组成 2）分辨率 指区分开两个质点间的最小距离。 几种介质的折射率 2、相差显微镜 发明： 1934~1935 荷兰物理学家Zernike 设计和发明相差显微镜，并获得诺贝尔奖。 相差： 在某一时间上，光的波动所能达到的位置，便是它的相位；两组波的相位不同，即相差。 相差显微镜的结构 聚光器或光源上增加一环形光阑，使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上； 物镜后装有一块“相差板”，相差板上涂有特殊吸光物质； 偏斜和未偏斜的两组光线之间增添了新的光程差，从而对样品密度的不同造成的相位差起“夸大”作用； 3.荧光显微镜 Fluorescence microscope 特点：光源为短波光； 有两个特殊的滤光片： 第一：激发滤片 第二：阻断滤片 荧光显微镜技术 4、激光共焦点扫描显微镜技术 原理： 是由一个激光扫描显微镜在物镜的成像面上加一个针孔组成，只有被照亮点发出的光才能通过共焦孔，偏离这一点的无用的荧光就被排除在最终的图像之外； 物镜和聚光镜同时聚焦到同一个小点，即它们互相共焦点，极大的增加了对比度； 逐点、逐行、逐面快速扫描，形成立体图像，能显示细胞样品的立体结构； 其他常用光学显微镜 倒置显微镜 其结构组成与普通显微镜一样，所不同的是它的物镜与照明系统的位置颠倒过来，物镜在载物台的下方，可直接对培养的细胞进行照明和观察。 二、电子显微镜技术 （一）电子显微镜的基本知识 1、基本构造 （二）主要电镜制样技术1、超薄切片技术 切片厚度一般仅为40～50nm 3、冷冻蚀刻电镜技术 基本操作过程： 将标本在标本台上于－196℃的液氮中超低温迅速冰冻；防止形成冰晶。 用冷刀将冻结的标本骤然断开； 当温度上升后，冰在真空条件下迅速升华，断裂面上的结构得以暴露（蚀刻）； 再喷涂上一层蒸气铂和碳； 将样品本身溶解掉，把喷涂上的碳和铂的膜剥离下来（复膜）； 电镜观察。 3、扫描电镜技术 ?工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出二次电子，二次电子的多少与样品表面形貌有关，二次电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 ? CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题 为了使标本表面发射出二次电子信号，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜。 三、扫描隧道显微镜 原理：利用量子力学中的隧道效应 （通常在低压下，二电极之间有很大的阻抗，阻止电流通过，称为叠势） 当二电极之间近到一定距离（100nm以内）时，电极之间产生了电流，称为隧道电流，并且隧道电流和针尖与样品之间的间距呈指数关系。将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。 第二节 细胞组分的分析方法 一、离心技术 差速离心 密度梯度离心 （二）流式细胞仪（Flow Cytometry） ?主要应用： ★用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特 异蛋白的含量； ★测定细胞群体中不同时相细胞的数量； ★从细胞群体中分离某些特异染色的细胞； ★分离DNA含量不同的中期染色体。 流式分选仪 （二）植物细胞培养 单倍体细胞培养：花药 原生质体培养：体细胞经纤维素酶处理去掉细胞壁 原生质体 (三)非细胞体系：由来源于细胞，而不具有完整的细胞结构与成分，但包含了进行正常生物学反应所需的物质（如供能系统和酶反应体系等）组成的体系。 用于DNA复制，RNA转录，蛋白质合成，高尔基体的膜泡运输，细胞核装配等 细胞提取物，细胞核提取物 思考题 选择题1．光学显微镜物镜放大倍数是40倍，目镜放大倍数是1