《乙肝病毒耐药基因测序》ppt课件.ppt

乙肝病毒耐药基因测序的临床应用 ◆DNA测序技术原理 ◆乙肝耐药基因测序特点 ◆耐药基因测序的应用 DNA测序技术原理 乙肝病毒结构 美国ABI3130型基因测序仪 本实验采用核酸扩增技术结合荧光标记探针杂交方法对乙型肝炎病毒DNA进行定量检测，其产物经过测序PCR反应，产物纯化后上3130测序仪进行毛细管电泳，得到测序峰图，从而完成耐药突变位点的检测。 HBV DNA 的提取 定量PCR反应 （ HBV DNA ≥ 5×103 IU/ml 的标本可以进行测序） PCR产物的酶解（SAP酶混合物） 测序PCR反应 （双脱氧终止法） 测序产物纯化 （乙醇纯化法） 上机测序 （毛细管电泳） 测序峰图分析 乙肝病毒P区耐药基因测序步骤 双脱氧终止法原理 病毒DNA定量分析得到HBV DNA ≥ 5×103 IU/ml 的标本可以进行后续的耐药基因测序 ，定量PCR产物经过SAP MIX的纯化后，进行测序PCR反应。 普通PCR与测序PCR反应的比较 普通PCR 测序PCR反应 （双脱氧终止法） DNA 聚合酶 Taq 酶 测序酶 引物 一对 单向 底物 dNTP dNTP+ddNTP(带荧光标记) 产物 等长的DNA片段 相差一个碱基的一系列片段 荧光标记 无 3’端带荧光标记 SAP MIX的作用 外切酶Exon I 降解定量PCR产物中残留的单链PCR引物。SAP酶除去定量PCR产物中残存的脱氧核苷三磷酸的磷酸基团，从而达到纯化定量PCR产物的目的。 经过SAP MIX 酶解纯化后的定量产物方可以进行后面的测序PCR反应。 测序PCR循环条件 96℃ 1min → (96℃ 10sec , 50℃ 5sec , 60℃ 4min) ×25 cycles →4℃恒温。 60℃ 4min的延伸时间是与普通PCR最大差别，目的是为了扩增出一系列相差一个碱基的ddNTP末端终止的DNA序列。 测序反应得到的产物经过酒精纯化，甲酰胺变性之后，可以上机进行毛细管电泳。 酒精纯化的目的是去除未结合的荧光染料终止物和残留的引物、盐离子、酶等。此步对测序成功非常关键，关系到测序峰图质量的好坏。 毛细管电泳原理 一、电进样与电泳 毛细管和电极深入样品溶液中，加电压，荷负电的DNA分子进入毛细管，在电场作用下向阳极泳动。 二、荧光激发和检测 带4色荧光标记的DNA片段按分子量从小到大依次经过激光检测区，激光激发荧光，产生长波长的荧光信号，荧光信号被CCD收集，软件将光学信号转换成电泳图谱。 HBV野生型质控的测序峰图 ↑ ↑ ↑ ↑ 173位点 180位点 181位点 184位点 ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ 202位点 204位点 207位点 213位点 214位点 215位点 ↑