热带念珠菌氟康唑耐药机制及粉防己碱对其逆转作用的分析-mechanism of fluconazole resistance in candida tropicalis and analysis of the reversal effect of tetrandrine on fluconazole resistance.docxVIP

热带念珠菌氟康唑耐药机制及粉防己碱对其逆转作用的研究摘要背景随着免疫缺陷人群的增多，侵袭性真菌感染的发病率不断增高，在某些地区热带念珠菌已成为仅次于白念珠菌的第二位常见念珠菌。而近年来，热带念珠菌对常用抗真菌药物氟康唑的耐药率呈上升趋势，耐药性已成为影响临床治疗热带念珠菌感染疗效的主要原因。因此，研究热带念珠菌耐药性的形成机制和寻找逆转其耐药性的有效药物是一项极其紧迫的课题。目的探讨临床分离的热带念珠菌氟康唑耐药性的机制及粉防己碱对其耐药性的逆转作用，为寻找和研究氟康唑耐药热带念珠菌的治疗提供理论依据。方法1、收集太原市中心医院检验科微生物室2010年1月—10月分离的200株念珠菌，并采用PCR-RFLP技术对其进行鉴定，即应用真菌的通用引物对核糖体DNA内部转录间隔区（ITS）序列进行扩增，MspⅠ酶切其PCR产物，以鉴定到种；2、运用ATBFUNGUS3药敏板条检测41株热带念珠菌对常用抗真菌药物的敏感性；PCR扩增氟康唑耐药菌株和敏感菌株靶酶基因ERG11基因并进行测序分析；RT-PCR检测其靶酶基因ERG11和外排基因CDR1、MDR1mRNA表达情况；3、MTT法测定TET对氟康唑耐药热带念珠菌临床分离菌株的最大非细胞毒性浓度，药敏试验分析非细胞毒性剂量的粉防己碱对5株氟康唑耐药热带念珠菌氟康唑MIC值的影响，流式细胞术检测其对热带念珠菌Rh123的蓄积能力的影响，RT-PCR分析粉防己碱作用前后，外排基因CDR1、MDR1及靶酶基因ERG11mRNA的表达的变化。结果1、应用PCR-RFLP方法对200株临床分离念珠株进行鉴定，共分离出白色念珠菌128株（64.0%），热带念珠菌41株（20.5%），光滑念珠菌11株（5.5%），近平滑念珠菌13株（6.5%），克柔念珠菌7株（3.5%），与微生物自动分析仪鉴定结果一致；2、41株热带念珠菌对5-氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑的耐药率分别为2.4%、0%、12.2%、7.3%、26.8%；ERG11基因测序结果显示，热带念珠菌氟康唑耐药株ERG11基因共存在4处错义突变（R245K两处，Y221F、V362I各一处），敏感菌株中没有发现错义突变；耐药菌株的ERG11、CDR1和MDR1基因mRNA的表达量均高于敏感菌株；3、TET对热带念珠菌的最大非细胞毒性剂量浓度为20μg/ml；经此浓度的TET作用后，氟康唑对5株耐药性热带念珠菌的MIC的范围由64-128μg/ml减少到16-64μg/ml，差异有统计学意义；粉防己碱作用组中，热带念珠菌对Rh123的蓄积量明显高于对照组；RT-PCR结果显示，粉防己碱可以下调耐药性热带念珠菌CDR1和MDR1基因mRNA水平的表达，但对ERG11基因的表达无明显作用。结论1、PCR-RFLP技术是鉴定临床常见念珠菌的有效手段，具有快速、准确、特异性高等优点；2、热带念珠菌的氟康唑耐药性与ERG11基因的错义突变有关，其中R245K，Y221F和V362I氨基酸置换可能影响其耐药性；此外，热带念珠菌的氟康唑耐药性与ERG11基因和外排基因CDR1、MDR1mRNA水平高表达有关；3、粉防己碱可以逆转热带念珠菌的氟康唑耐药性，逆转机制与减少外排蛋白的表达，增加细胞内药物的蓄积有关。关键词：热带念珠菌；氟康唑；耐药；粉防己碱MechanismsandtheReverseEffectofTetrandrineonFluconazoleResistanceinClinicalIsolatesofCandidatropicalisAbstractBackgroundInrecentyears,invasivefungalinfectionhaveincreaseddramatically,largelybecauseoftheincreasingsizeoftheimmunecompromisedpopulation,especiallyAIDpatients.CandidatropicaliscurrentlyranksasthesecondorthirdmostfrequentlyisolatedCandidaspeciesfromallreportedcasesofcandidiasisinsomeareas,secondonlytoCandidaalbicans.Candidatropicalisinfectionsareparticularlyimportantbecauseoftheirincreasedresistancetoantifungalagents.TheriseofthenumberofCandidatropicalissystemicinfectionsdeservesagreatdeal