厚荚相思的遗传转化和CAld5H基因的克隆.docVIP

厚荚相思的遗传转化与CAld5H基因的克隆 作者：杨明嘉郑彩霞教授研究意义厚荚相思（Acacia crassicarpa A. Cunn. ex Benth.）是一种重要的多用途，热带、亚热带豆科（Fabaceae L.）树种。在东南亚地区，尤其是印度和中国，已被广泛的应用于造林、开荒和纸浆用材生产。木质素是植物体中仅次于纤维素的一种重要大分子有机物质，具有重要生物学功能。然而，木质素的存在不利于资源植物的应用。制浆造纸的中心环节是用大量化学品将原料中的木质素与纤维素分离，纤维素用于造纸，分离的木质素形成造纸工业的主要废弃物，对环境造成极大污染，脱木质素的化学品投入及废液的碱回收处理需大量耗能从而增加造纸成本。为了从源头上减少污染、实现清洁高效生产纸浆，用基因工程方法培育材性优良、尤其是木质素含量低或结构改变的相思树，可大大降低造纸工艺中的成本以及造纸带来的污染。 4CL酶（4-coumarate:CoA ligase）即4-香豆素辅酶A-连接酶是木质素合成途径中的调控酶，决定木质素合成中苯丙氨酸途径的最后一步反应，主要催化羟基苯乙酸到相应的硫酯的反应，可以利用不同的底物来调节木质素合成（香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸等）。转基因植物研究表明，不同植物的4CL功能不尽相同，但抑制4CL的转基因植物（杨树、烟草）的木质素含量均明显降低。本研究试图通过转化反义4CL基因改变厚荚相思的木质素含量，为其基因工程育种奠定理论实践基础。另外一种木质素调控的目标是改变木质素的结构，使其更容易被降解。松柏醛5-羟化酶CAld5H基因的转化提供了一条可能的途径。CAld5H基因负责调控木质素S/G（syringyl /guaiacyl）比值。由于G-S型木质素比纯粹的G型木质素易于降解，所以激活CAld5H酶的活性，与CAD竞争底物松柏醛，通过芥子醛合成更多的S型木质素单体，从而相对降低G型单体的合成目的。克隆得到厚荚相思的基因是基因转化的的第一步。 综上所述建立高效厚荚相思再生体系，开展相思树遗传转化的研究，培育相思树新品种具有十分重要的现实意义。本研究对相思中的重要树种厚荚相思进行了农杆菌介导的基因转化体系和功能基因克隆的研究，为基因工程改良相思经济性状奠定了坚实的基础。研究内容厚荚相思体外再生体系的建立厚荚相思优良无性系的选择；取厚荚相思的子叶、下胚轴和假叶作为外植体，优化其再生、伸长、增值及生根条件，建立厚荚相思体外再生体系； 2．厚荚相思遗传转化受体系统的建立测定厚荚相思体外再生体系对抗生素的敏感性，主要包括不定芽诱导、丛生芽生长和不定芽生根对Km（kanamycin）和Car（carbenicillin）的敏感性； 双元载体pBK-4CL（Li L et al. 2003）对农杆菌的转化程序的优化。确定预培养时间、侵染时间、共培养时间、AS影响和推迟筛选时间； 含反义4CL基因表达载体的农杆菌对相思树的转化，筛选，获得再生植株； 转基因相思树的分子生物学鉴定（PCR，Southern blot）；molecular analysis of transgenetic plants. 转基因相思的木质素、纤维素含量的测定； 3．厚荚相思假叶RNA提取方法的优化。采用Trizl法、改良的热硼酸盐法、CTAB法和RNA提取试剂盒法从厚荚相思体外培养的叶片中提取总RNA对比哪一种方法所提的RNA纯度高、质量好； 厚荚相思重要功能基因CAld5H的克隆，测序与分析。结果与讨论本论文对厚荚相思的体外再生体系进行了研究。探讨了厚荚相思体外再生、增殖、伸长和生根培养条件及移栽所需的条件。通过农杆菌介导的基因转化厚荚相思。研究了预培养时间、侵染时间、共培养时间、抗生素筛选程序等遗传转化的必要条件对转化效果的影响；对转化植株进行了PCR-Southern检测。通过多种方法提取厚荚相思假叶的RNA；根据同源性设计了CAld5H基因的兼并引物，通过RT-PCR方法检测RNA逆转录活性。结果如下： 在国际上首次报道了有关厚荚相思通过器官发生方式的体外再生体系：以厚荚相思假叶为外植体，在培养基MS+3% (w/v) 蔗糖+0.4% (w/v) 琼脂+0.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA上诱导外植体分化不定芽，不定芽分化率为56%。不定芽增殖培养基为MS+3% (w/v) 蔗糖+0.4% (w/v) 琼脂+1.0 mg/L BA。诱导不定芽伸长的最佳培养基为MS +3% (w/v) 蔗糖+0.4% (w/v) 琼脂+0.1 mg/L TDZ。伸长后的不定芽在MS+3% (w/v) 蔗糖+0.5% (w/v) 琼脂+0.5 mg/L IBA上生根，生根率可达96%。经过炼苗和移栽，厚荚相思再生苗的成活率可达80%。为利用基因工程的手段对此树种进行改