水稻锌高效营养相关基因的定位与克隆.docVIP

水稻锌高效营养相关基因的定位与克隆 本项目以锌高效品种（IR8192）及锌低效品种（二九丰）为材料，结合生物信息学分析、生化测定及分子生物学技术，研究了水稻锌高效营养生理机制，探讨与水稻锌高效营养相关的转运子候选基因。研究表明，水稻锌高效营养与其低锌条件下相对高效的光合能力有关；锌高效品种具有较高的抗氧化酶活性，能够维持较低的受氧化胁迫水平及较为完整的细胞超微结构，进一步证实了缺锌引起自由基积累并导致伤害的假说，并总结出高的锌生物有效性、高效的氧自由基清除系统是水稻锌高效的重要机制；同时筛选出了与水稻锌高效相关的备选基因，为提高水稻锌营养效率提供了新的研究视角。二年来本项目研究成果已经在国际SCI期刊上发表论文3篇。 一、主要研究内容及研究方法 二年来，项目研究基本按计划进行，完成了预定的全部研究内容，取得了预期结果。根据项目研究计划，本项目立项以来的研究内容及相应研究方法如下： 1、锌高效营养性状相关的基因分子标记试验 利用一对锌高效和锌低效水稻基因型为材料两个，对引物的筛选，初步确定有差异条带的引物；再扩大到两对品种进行进一步的筛选，得到具有稳定差异条带；对特异性片段进行克隆测序，并通过BLAST确定所在基因。 水培培养锌高、低效基因型杂交F2代群体100株，在叶期前后收获幼苗，通过新叶长势、根冠比等指标确定其锌高/低效；同时每株提取DNA，用已经筛选出的引物进行PCR扩增实验，以建立分子标记与F2代群体的性状联锁试验，同时定位与锌高效营养相关的新基因。利用Northern blot方法，进一步研究这新基因表达与锌吸收的关系。 2、与锌转运相关转运子ZIP基因家族的筛选 用基于隐马可夫模型（hidden Markov model，HMM）的软件HMMER 2.3.1（http：///）搜索水稻的全基因组ZIP蛋白。首先从PIR数据库(http：///pirwww/search/textsearch.html)中获得所有植物ZIP家族(PF02535)成员，从已知78个成员中选取序列信息完整的28个转运蛋白序列，用ClustalW v1.83（从EBI下载，ftp.ebi.ac.uk/pub/software）对其进行联配，分别从左右两端删除相似性差的区域，以此建立植物ZIP的HMM profile，再用HMM search工具(E值取0.1)搜索水稻蛋白质序列数据库（OSA1.pep，ftp：///pub/data/o_sativa/irgsp/PUBLICATION_RELEASE/GENOME/），从TIGR(http：///tdb/e2k1/osa1/LocusNameSearch.shtml)下载上述搜索结果的序列与注释信息。为获得水稻全基因的ZIP蛋白，进一步用以OsIRT1 和 OsZIP1-4为对象，用tBLASTn 搜索了RGP (http：//riceblast.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/robo-blast/blast2.cgi?dbname=all) 和 KOME (http：///db/searches/blast)数据库，从GRAMENE (http：///) 或KOME (Kikuchi et al., 2003) 或 TIGR下载比对的序列和注释信息。最后用BLAST比对结合序列注释信息去除冗余序列。通过以下3道程序确认水稻ZIP基因注释的正确性：①预测氨基酸的多序列联配；②基因组编码序列与全长cDNA序列比较；③根据已报道的ZIP保守结构特征验证预测ORF与内含子结构的准确性。 序列联配和系统发生学分析。用TMHMM (http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析水稻所有推定ZIPs序列中可能的转膜域，用WoLF PSORT (http：//wolfpsort.seq.cbrc.jp/)分析其中的信号肽与细胞靶点，在用ClustalW v1.83程序进行多序列联配的基础上，用PHYLIP 3.6 软件包（http：///phylip.html）构建水稻全基因组ZIP及其它几个植物中已知ZIP家族成员的邻位相接法系统进化树，并进行Bootdtrapping 分析，用TreeView (v1.6.6) (http：//taxonomy.zoology.gla.ac.uk /rod/treeview.html)显示未做任何修正的进化树。 3、新的锌转运子的筛选： 在无锌条件进行水稻发芽，长至三叶初期进行锌处理锌处理20天后，每处理随机取3株水稻用于总RNA提取，提取分地上部及根部两部分进行，采用TRIZOL试剂提取（Invitrogen, Carlsbad, CA, United States），