化学之运动分离技术.PPT

* 4. 影响电泳分离的因素 待分离组分性质：所带的电荷、分子大小和性质。电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。 缓冲液的性质：影响解离度、电泳方向。为了保持电泳分子稳定性，缓冲液通常要保持一定的离子强度，一般在0.02－0.2mol/kg。离子强度过低，则缓冲能力差，但如果离子强度过高，会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛）。由于离子氛与待分离分子的移动方向相反，它们之间产生了静电引力，因而引起电泳速度降低。另缓冲液粘度也影响电泳速度。 电场强度：电场强度越大，电泳速度越快。但增大电场强度会引起通过介质的电流强度增大，而造成电泳过程产生的热量增大，产生如下影响： 样品和缓冲离子扩散速度增加，会引起分离带加宽； 产生对流，引起待分离物的混合； 若样品对热敏感，会引起蛋白等活性物质变性； 引起介质粘度降低、电阻下降等。 电场强度增加，介质中心温度较高，导致电泳速度比边缘快，电泳分离带呈弓型；降低电流强度，可以减小生热，但会延长电泳时间，引起分子扩散增加而影响分离效果。故电场强度要合适、适当冷却降温可获较好分离效果。 电渗：液体在电场中，对于固体支持介质的相对移动，称为电渗现象。 由于支持介质表面可能会存在一些带电基团，这些基团电离后会使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，从而形成介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗。 如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加快电泳速度；如果相反，则降低电泳速度。 尽量避免选择具高渗透作用的支持物。 支持介质的筛孔：在筛孔大的介质中泳动速度快，反之，则泳动速度慢； 其他：黏度，粒子间相互作用，温度变化等 * 5、电泳种类：根据有无支持物 自由电泳：无支持物 显微电泳 等电聚焦电泳 等速电泳 区带电泳：有支持物 有纸电泳 薄层电泳 凝胶电泳 毛细管电泳 * ①纸电泳、醋酸纤维素膜电泳： * ②凝胶电泳：gel electrophoresis，GE * ③等电聚焦电泳技术isoelectric focusing，IEF 利用有pH梯度的介质分离不同等电点蛋白质的电泳技术。 * ④毛细管电泳capillary electrophoresis，CE 毛细管电泳仪 按毛细管内填充物形状：自由溶液、非自由溶液 按机理：电泳型、色谱型、电泳?色谱型三类。 * 复习与巩固 详见实验化学讲座思考练习题 * * 薄层扫描法鉴别： 四、薄层色谱的定性分析 （1）斑点的原位光谱扫描定性 * （2）薄层色谱的全程扫描定性 * （3）薄层的三维扫描光谱图定性 * （4）与其他方法联合定性 TLC-MS联用仪： * 定量分析：半定量和定量 半定量方法：估计含量，如限量检查； 定量方法： 间接定量—— 洗脱测定 直接定量—— 薄层扫描测定：主要包括吸收扫描法和荧光扫描法 五、定量分析 * 1、薄层扫描定量分析的基本原理 （1）薄层吸收扫描法的原理：郎伯比耳定律 透射比反射线性关系好 * （2）薄层荧光扫描法的基本原理： φ为效率常数； a为吸光系数； b为薄层斑点厚度 * 2、薄层色谱扫描法定量分析方法 （1）外标法 ① 外标一点法： ② 外标二点法： * ③ 回归方程计算法： * （2）内标法 * （3）归一化法 采用该方法的条件是： 被分析的各个组分在分子量、吸收系数等性质上差别较小， 组分斑点的面积均在线性范围内， 样品中所有组分均被分离且被有效扫描。 * 1、薄层色谱扫描仪的基本构成 主机（硬件）：主机部分与分光光度计类似，由光源、分光系统、薄层板放置仓（相当于样品池）、检测器等 数据处理与信号输出系统（软件）等部分组成。 六、薄层色谱扫描仪 * 2、薄层色谱仪的扫描方法 扫描方法：一般采用双波长测定，可用反射法或透射法得到信号。 扫描方式：线形、齿形、环形扫描，多通道扫描等 六、薄层色谱扫描仪 * 薄层色谱扫描软件 * 七、薄层色谱法在药学领域的应用 在中草药与中成药分析中的应用 中药材的品种鉴别 中成药的鉴别 中药薄层指纹图谱鉴别 中草药成分分析 中成药的含量测定及质量标准研究等 薄层色谱法在合成药物分析中的应用 药典仅限于合成药的定性鉴别和纯度检查 2010中国药典二部采用TLC进行鉴别和纯度检查的品种数量共435个（约占收载总数的19%） 也用于含量测定、稳定性考察、体内药物测定及代谢研究、生化药物及抗菌素分析等。 * 专属性较强的薄层色谱鉴别技术在2005年版《中国药典》一部（中药）共收载薄层色谱鉴别1507项，而2010年版药典仅新增薄层色谱鉴别就达2494项之多，除矿物药外均有专属性强的薄层鉴别方法，TLC鉴